各种监测微生物生长情况的方法

有多种方法可用于监测微生物的生长情况，具体选择取决于多种因素，包括样本的性质以及预期的微生物数量。直接细胞计数（Direct cell counts）特别适用于确定样本中微生物的总数，但通常无法区分样本中的活细胞和死细胞。测定悬浮液中细胞浓度最快的方法是直接显微镜计数（Direct microscopic count）。将液体样本加入到血细胞计数器（Hemocytometer）中，这是一种专门设计用于计数细胞的特殊玻璃片。该计数器有一个薄的腔室，上面放置着一定体积的液体，并覆盖在微小的网格上。腔室内的内容物可以在光学显微镜下观察，从而可以精确地计算出给定体积内的细胞数量。

库尔特计数器（Coulter counter）是一种电子仪器，它通过让悬浮液中的细胞单列通过狭窄通道来计数细胞。流式细胞仪（Flow cytometer）在原理上与库尔特计数器类似，不同之处在于它测量细胞通过激光时散射的光。活细胞计数确定的是能够繁殖的细胞数量。这种计数方法在处理诸如食物和水这类微生物数量过少而无法进行直接显微镜计数的样本时尤其有用。

平板计数（Plate counts）通过利用这样一个原理来测量样本中的活细胞数量：在琼脂培养基上单个的微生物细胞会形成一个菌落。通过简单地对菌落进行计数，可以确定初始样本中的细胞数量。平板计数通常仅在样本中每毫升含有超过 100 个微生物时才进行。在计数菌落时，平板上的理想菌落数应在 30 至 300 之间。超出这个范围的数字更有可能是不准确的。在平板分散法（Spread-plate method）中，将稀释后的样本 0.1 - 0.2 毫升转移到一个凝固的琼脂培养基平板上。然后用一根经过消毒的弯曲玻璃棒（类似于微型曲棍球杆）在琼脂表面涂抹均匀。在倾注平板法（Pour-plate method）中，将 0.1 - 1.0 毫升稀释后的样本转移到一个无菌的培养皿中；然后加入冷却至 50°C 的熔化琼脂培养基。培养后形成的菌落数量被用于确定样本的菌落形成单位（colony-forming units, CFU）浓度——这是一种衡量存活细胞数量的指标，因为它考虑到了微生物细胞常常相互粘连然后生长形成单个菌落这一情况。

对于含有相对较少细胞的液体样本（例如在湖泊或其他自然水域中可能出现的情况），膜过滤法（Membrane filtration）被用于计数微生物。将一定体积的液体通过一个具有足够小孔径以防止微生物通过的无菌膜过滤器进行过滤。微生物悬液的浑浊度或浊度与细胞浓度成正比，并通过分光光度计进行测量。一旦完成了这种相关性测定（通常使用直接显微镜计数或平板计数来确定细胞浓度），浊度测量（Turbidity）就成为一种快速且相对准确的检测方法。培养物的总重量可以用来衡量生长情况，但这种方法既繁琐又耗时。正因为如此，通常会以总重量来研究那些不易分离成单个细胞（从而无法进行有效平板计数）的丝状生物。

微生物在新陈代谢过程中会产生多种酸，有时还会产生气体。可以通过在培养基中加入酸度指示剂来检测酸的存在。有几种酸度指示剂可供选择，它们在颜色变化的 pH 值上有所不同。为了检测气体的产生，可以使用倒置管（杜伦管，Durham tubes）来捕获液体培养物中的气泡。临床实验室会使用更灵敏的方法来检测细菌在患者血液样本中生长所产生的微量二氧化碳。有一种方法是使用荧光传感器来检测伴随二氧化碳产生而出现的轻微的 pH 值下降。用于检测生长，但不常用于定量。不同的方法各有优势，应根据具体需求进行选择。

Figure 1. membrane filtration (derived from Anderson, D. G., Salm, S., & Beins M. (2022))

参考文献：Anderson, D. G., Salm, S., & Beins M. (2022). Microbiology: A human perspective.)