三重信号放大实现黄曲霉毒素B1超灵敏检测

研究背景

黄曲霉毒素B1（AFB1）是黄曲霉菌产生的次级代谢产物，被世界卫生组织国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物。它在花生、玉米、谷物等农产品中广泛存在，具有极强的肝毒性和致癌性。即使极低浓度（ng/kg级别）的AFB1长期暴露也会导致肝癌风险显著增加，因此开发高灵敏度的检测方法对保障食品安全至关重要。

传统AFB1检测方法如高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）虽然准确度高，但需要昂贵的仪器、专业的操作人员和复杂的样品前处理，难以实现现场快速检测。酶联免疫吸附测定（ELISA）虽然操作相对简便，但天然酶的稳定性差、成本高，且易受环境因素影响，限制了其广泛应用。

光电化学（PEC）传感器是近年来快速发展的检测技术，其激发光源与检测信号分离的特点能有效降低背景干扰，提高检测灵敏度。然而，传统PEC传感器的特异性不足，需要在复杂食品基质中实现选择性检测。核酸适配体因其高亲和力、稳定性好、易于合成和修饰等优点，成为理想的分子识别元件。将适配体与PEC传感器结合形成的PEC适配体传感器，为AFB1检测提供了新的技术路径。

研究原理

本研究设计的纳米酶基PEC适配体传感器采用了创新的三重信号放大策略，从材料设计、催化反应和探针放大三个层面协同提升检测性能。

（1）第一重放大：高效光电转换材料设计

研究团队构建了空心CdS纳米立方体（h-CdS）与TiO₂的异质结作为光电转换基底。TiO₂虽然稳定性好、成本低，但其宽带隙（∼3.2 eV）限制了其对可见光的吸收。而CdS的窄带隙（∼2.4 eV）可作为光敏剂扩展光谱响应范围。

空心结构的h-CdS具有多重优势，可以增强光散射和光吸收、缩短电荷传输距离、促进质量传递、提高光电转换效率。通过前体离子交换策略合成的h-CdS具有规整的立方体形态，尺寸约200 nm，壳层厚度约20 nm（图1A-C）。XRD和HRTEM分析确认其为立方闪锌矿结构（图1D）。UV-vis DRS显示h-CdS的吸收边为555 nm，明显红移于固态CdS的500 nm，证明空心结构增强了可见光吸收（图1G-H）。

图1. 材料表征及检测原理示意图

Mott-Schottky测试和DFT计算揭示了异质结的能带结构和电荷转移机制（图1I-L）。h-CdS的导带（-0.96 eV）比TiO₂（-0.66 eV）更负，表明光照下光生电子可从h-CdS转移至TiO₂。电荷密度差图显示电子在TiO₂侧积累，在h-CdS侧耗尽，证实了Type-II异质结的形成，有效促进了电子-空穴对分离。

（2）第二重放大：双酶模拟单原子纳米酶催化

研究团队通过级联锚定策略合成了单原子Fe-MNC纳米酶，其具有过氧化物酶和氧化酶双模拟活性，能高效催化生物催化沉淀（BCP）反应。首先以ZIF-8为前体，经高温热解和KOH活化得到介孔氮掺杂碳（MNC），然后通过葡萄糖辅助的吸附-热解过程将Fe原子锚定在MNC上。AC HAADF-STEM图像显示孤立的亮斑（图2C），对应碳基质上的单个Fe原子。XRD未见Fe或Fe氧化物衍射峰（图2D），证明Fe的原子级分散。XPS分析显示Fe 2p₃/₂位于727.3 eV，且存在Fe³⁺和Fe²⁺混合价态（图2F）。EXAFS拟合确认Fe的配位数为4，形成FeN₄构型（图2H-I）。

图2. 单原子纳米酶的材料表征

之后对酶活性进行检验，Fe-MNC在H₂O₂存在下能催化TMB氧化产生蓝色产物，表现出过氧化物酶活性（图3A）。有趣的是，即使无H₂O₂，Fe-MNC也能催化TMB氧化，表明其具有内在氧化酶活性，可通过活化溶解氧产生超氧阴离子（O₂•⁻）（图3B）。ESR分析使用DMPO作为自旋捕获剂，在PBS中检测到DMPO-OH•加合物的特征四重峰（1:2:2:1），证实了•OH的生成；在甲醇中观察到DMPO-O₂•⁻的1:1:1:1信号，证明了O₂•⁻的产生（图3C-D）。稳态动力学分析显示，Fe-MNC对TMB和H₂O₂的Kₘ值分别为0.245 mM和46.535 mM，表明其对底物有强亲和力（图3E-F）。与Co、Ni、Pt等其他过渡金属单原子纳米酶相比，Fe-MNC表现出最高的催化活性（图3H）。

图3 单原子纳米酶的活性分析

（3）第三重放大：杂交链式反应（HCR）探针放大

为实现目标物特异性识别和进一步信号放大，研究团队基于AFB1适配体设计了两个发夹DNA探针H₁和H₂，构建了HCR放大系统。当适配体存在时，其a区域与H₁的a区域杂交，占据竞争性b位点，触发H₁发夹结构打开。这暴露了c区域，使其与H₂杂交，导致H₂发夹展开，暴露出新的a和b区域，进而重新激活H₁。这种链式反应最终形成长的双链串联结构Apt-[H₁-H₂]ₙ。当加入AFB1后，适配体优先与AFB1结合，失去启动HCR的能力，导致HCR产物条带显著减弱。荧光动力学实验进一步证实了HCR的时间依赖性形成。将链霉亲和素标记的Fe-MNC纳米酶通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在Apt-[H₁-H₂]ₙ复合物上。当AFB1存在时，竞争性结合导致更多纳米酶从光电电极表面解离，显著放大了催化信号。

研究结果

传感器对AFB1的检测表现出卓越的分析性能（图4C-D）。光电流与AFB1浓度的对数在0.005-100 pg/mL范围内呈良好线性关系，线性回归方程为I (μA) = 1.61 log cAFB1 (pg/mL) + 8.41，相关系数R² = 0.996。检测限低至2.04 fg/mL，比已报道的大多数AFB1检测方法低1-3个数量级。稳定性测试显示，在200秒内连续20次光开关循环中，光电流响应几乎保持不变（图4E）。传感器在4°C黑暗条件下储存4周后仍保持良好稳定性。三批独立合成的h-CdS和Fe-MNC表现出高度一致的性能，相对标准偏差（RSD）为1.57%，证明合成方法可靠。选择性评估中，AFB2、AFG1（AFB1结构类似物）以及赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等其他常见霉菌毒素仅引起光电流的微小非显著性变化（图4F），表明传感器对AFB1具有高特异性。

图4 传感器性能检验

为评估实际应用能力，研究团队测试了多种真实样品，包括草果、咖啡豆以及 visibly霉污染的玉米、小麦和酸枣仁。样品经提取和衍生化后，用开发的传感器进行AFB1检测，结果与HPLC对比。传感器检测结果与HPLC高度一致，在阴性样品（咖啡豆和草果）中未检测到AFB1，显示低假阳性率。加标回收实验显示优异回收率，进一步证实了传感器在实际应用中的可靠性。

总结与展望

在这项研究中，我们开发了一种新型的基于纳米酶的PEC适配传感器，用于AFB1的超灵敏检测，具有集成的协同三重信号放大策略。h-CdS的空心结构拓宽了光吸收边缘，增强了光散射，改善了质量传输，同时与TiO₂形成异质结，有效促进电荷分离并促进光电转换。具有双酶模拟活性的单原子Fe-MNC纳米酶的结合实现了高效的BCP反应驱动信号放大，基于HCR的核酸扩增提供了靶标特异性识别和额外的信号增强。这三个元件共同作用，实现了完全集成的设计，最大限度地提高了灵敏度和选择性。与HPLC和ELISA等传统技术相比，所提出的传感器具有显着的优势，包括成本更低、检测速度更快、稳定性强、环境适应性强，以及小型化和现场分析的潜力。得益于这种协同设计，该传感器表现出优异的灵敏度、宽线性范围、高特异性和良好的重现性。虽然该系统在 AFB1 监测方面显示出巨大的前景，但其单目标设计可能会限制在多种霉菌毒素经常共存的现实世界食品基质中的适用性。因此，未来的努力应集中在开发能够同时检测多种霉菌毒素的多重 PEC 传感平台上。

原文链接: https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.118196