非光谱多重分子诊断，可同时检测病原菌的毒力和抗生素耐药基因

1.引言

近年来，抗生素的广泛使用加速了抗药性细菌的出现，这对全球公共健康构成了严重威胁。抗药性通常由质粒介导，这些质粒在细菌间传递抗药性基因，将敏感菌株转化为抗药性菌株。因此，迫切需要能够同时识别病原菌基因组DNA和质粒编码抗药性基因的诊断平台，以指导有效治疗并限制抗药性感染的传播。

本研究开发了一种简化的非光谱多重分子诊断技术，通过将环介导的等温扩增（LAMP）与基于逆行反射Janus微粒（RJP）的非光谱光学检测方法相结合，解决了传统多重分子诊断工具的复杂性和高成本问题。该技术能够在等温条件下生成双标记DNA扩增子，并通过抗原-抗体相互作用和亲和素包被的RJP进行信号转导，实现对不同DNA目标的单一探针检测。作为模型检测，我们同时检测了鼠伤寒沙门氏菌的invA基因和质粒编码的四环素抗性基因tetA，均获得了低至0.59 CFU/反应的检测限，展示了其在食品安全和临床环境中的强大应用潜力。

图 1 所开发非光谱多重定量平台的检测策略示意图，用于检测和定量抗药性鼠伤寒沙门氏菌。

2.结果与讨论

不同LAMP方法的扩增效果比较：通过比较传统LAMP方法、LFe和LBc应用LAMP方法以及优化的LFe应用LAMP方法在65℃、35分钟下的扩增效果，发现优化的LFe应用LAMP方法在低至1 CFU/反应的浓度下表现出良好的扩增效果，信号强度随浓度增加而增加，最高至10⁴ CFU/反应。

图 2 比较三种不同的环介导等温扩增（LAMP）方法在65°C、35分钟下的扩增效果：（A）使用正向环引物（LF）和反向环引物（LB）的传统LAMP方法；（B）应用LF互补序列（LFe）和LB互补序列（LBc）的LAMP方法；（C）应用LFe的LAMP方法；（D）DNA梯度的放大图像。（CFU=反应中的CFU/反应）

表面修饰验证：通过酶介导的显色反应验证了传感表面的抗体和生物素固定化情况。结果显示，目标特异性抗体通道呈现蓝色信号，而阴性对照通道（小鼠IgG和乙醇胺修饰通道）未观察到颜色变化，表明表面修饰具有高度特异性。

图 3 靶标特异性分析的表面修饰验证。（A）Si玻璃表面用捕获分子固定的示意图。（B）基于酶介导的发色测定的表面修饰确认。

抗药性鼠伤寒沙门氏菌的RJP定量分析：使用RJP对不同浓度的抗药性鼠伤寒沙门氏菌（0至10⁵ CFU/反应）进行定量分析。结果表明，优化的LAMP产物稀释度和RJP反应时间下，invA和tetA目标在1至10⁴ CFU/反应的动态范围内表现出可靠的定量效果，背景信号低，检测限为0.59 CFU/反应。

图 4 基于逆行反射Janus粒子（RJPs）的抗生素抗性鼠伤寒沙门氏菌从0到10⁵CFU的定量分析。（A）invA LAMP产物定量观察到的RJPs图像。（B）表示invA AMP产物分析产生的RJP数量的图表。（C）tetA LAMP产物定量观察到的RJPs图像。（D）表示tetA LAMP产物分析产生的RJP数量的图表。所有测试均进行三次，误差线表示标准差。（CFU=反应中的CFU/反应）

平台性能评估：评估平台对野生型和抗药性鼠伤寒沙门氏菌的区分能力。结果显示，平台能够有效区分仅含invA基因的野生型菌株和同时含invA和tetA基因的抗药性菌株，验证了平台的高特异性和可靠性。

图 5 开发平台的同时检测鼠伤寒沙门氏菌和抗生素抗性基因的性能评估。（A）每个通道观察到的RJPs图像。（B）表示每个通道产生的RJP数量的图表。测定重复三次，误差线表示标准差。（CFU=反应中的CFU/反应）

混合LAMP产物的定量分析：通过混合不同浓度的invA和tetA LAMP产物，评估平台在复杂条件下的性能。结果表明，即使在高浓度非目标LAMP产物存在下，平台仍能准确检测目标基因，表现出良好的选择性和稳定性。

图 6 使用两种目标LAMP产物的混合物进行定量分析。（A）使用混合样品对invA进行定量分析。（B）使用混合样品对tetA进行定量分析。（C）使用混合样品对传感芯片进行验证。（CFU=反应中的CFU/反应）

3.总结

本文介绍了一种集成了环介导等温扩增（LAMP）与逆行反射Janus微粒（RJP）非光谱光学检测方法的简化平台，用于同时检测病原细菌和质粒编码的抗生素抗性基因。该平台能够在等温条件下生成双标记DNA扩增子，并通过抗原-抗体相互作用和亲和素包被的RJP进行信号转导，实现单一RJP探针的多重目标DNA检测。以鼠伤寒沙门氏菌的invA基因和四环素抗性tetA基因为模型，该平台展示了高灵敏度和特异性，具有现场快速识别和抗性谱分析的能力，适用于食品安全和临床环境中的即时检测。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.118198