一芯片双检测：无需光谱仪的多重分子诊断平台精准狙击耐药菌

研究背景

抗生素的广泛使用导致耐药菌株的迅速出现与传播，已成为全球公共卫生领域的重大威胁。耐药性常由质粒介导，通过水平基因转移在细菌间传播耐药基因，使得原本敏感的菌株转变为耐药株。因此，开发能够同时识别病原菌基因组DNA与质粒编码耐药基因的诊断工具，对于指导精准治疗、遏制耐药菌传播具有重要意义。

传统耐药性检测方法，如培养法与ELISA，虽特异性高，但耗时长、操作繁琐，难以满足现场快速筛查需求。尽管qPCR等高灵敏度分子技术已广泛应用，但其依赖热循环仪与复杂荧光光学系统，限制了在资源有限地区的普及。因此，亟需发展一种简化、快速、且具备多重检测能力的诊断平台。

研究原理

本研究整合了环介导等温扩增与逆向反射Janus微粒光学检测技术，构建了一种非光谱型多重分子诊断系统。其核心原理如下：

1. LAMP扩增与双标记策略

研究人员设计了特殊的LAMP引物系统，包含六条引物，其中两条经过修饰：一条连接抗原小分子（如FITC或Texas Red），另一条连接生物素。在等温条件下，扩增产物为双末端标记的DNA片段，一端为抗原小分子，另一端为生物素。

图1 平台检测策略示意图

2. 表面捕获与信号转导

在传感芯片表面，固定有针对不同抗原小分子的抗体。扩增产物通过抗原-抗体反应被特异性捕获于相应通道。随后，加入亲和素包被的逆向反射Janus微粒。RJP与生物素结合后，形成“抗体-扩增子-RJP”三明治结构。

3. 非光谱光学检测

RJP具有将入射光沿原路返回的特性。当LED光源照射芯片时，被RJP反射的光线由普通CMOS相机捕获。信号强度与目标DNA浓度成正比，无需复杂光谱设备即可实现定量分析。

图2 三种LAMP方法的扩增效率

研究结果

1. 高灵敏度与宽动态范围

平台对鼠伤寒沙门氏菌的invA基因（基因组）与tetA基因（质粒）进行同步检测，检测限低至0.59 CFU/反应，相当于196 CFU/mL。动态范围为1–10⁴ CFU/反应，覆盖了从极低污染到高风险水平的实际应用需求。

图4 invA与tetA基因的RJP定量结果

2. 优异的选择性与多重检测能力

通过设计特异性引物与通道分离，平台成功区分野生型与抗生素耐药型沙门氏菌。在混合样品实验中，即使存在高浓度非目标扩增子，也未出现交叉反应或信号干扰。

图5 三通道芯片在不同样品中的RJP信号分布

3. 表面修饰与探针功能验证

通过酶促显色反应与荧光显微镜确认了抗体与生物素在传感表面的成功固定，以及RJP表面亲和素的有效修饰，保障了检测的可靠性与重复性。

图3 表面修饰验证实验

4. 混合样品中的稳定性

即使在invA与tetA扩增产物混合的情况下，各检测通道仍保持高度特异性，参考通道信号稳定，证实平台在复杂样本中仍具备可靠性能。

图6 混合扩增产物条件下，invA、tetA及参考通道的信号响应

效果及展望

本研究通过将LAMP与反射信号结合，开发了一个非光谱多重定量平台，同时分析细菌中的基因组和质粒DNA。该系统免除了热循环器或复杂光学设备的需求，使分子诊断更为便捷。鼠伤寒沙门氏菌检测的浓度范围为1-10⁴CFU/反应（3.3 × 10¹到3.3×10⁵CFU/mL）。该平台的一个显著优势是能够以高灵敏度检测低至1 CFU/反应，这归因于其极低的背景信号。这是通过优化双标记扩增子的浓度和RJPs的反应时间实现的。此外，即使将非靶标扩增剂掺入DNA混合物，平台也仅特异性检测到目标目标。这些结果表明该平台能够同时检测致病细菌和抗生素耐药基因，从而在单芯片上提供可靠的验证。此外，它通过引入新的小分子抗原和抗体对，展现出扩展潜力，期望在单芯片上检测到更广泛的抗生素耐药基因。

原文链接: https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.118198