Food Chemistry：基于纳米酶的混合模式传感器用于光电解和比色法检测单增李斯特菌

由单增李斯特菌（Listeria monocytogenes, L. monocytogenes）引起的食源性疾病对人类和动物物种构成重大健康风险。与其他病原体相比，单增李斯特菌在极端环境条件下，例如低温和高盐度水平下，表现出显著的生存能力。因此，制定一种高度特异性和快速的检测策略以最小化食品污染相关风险至关重要。

目前，检测单增李斯特菌的传统方法主要依赖于常规细菌培养、分子生物学技术和酶联免疫吸附试验（ELISA）。然而，这些方法耗时且过程复杂，成本高，极大地限制了它们的应用范围。近年来，由于其固有的高灵敏度、快速响应时间和低背景干扰等优点，光电化学（PEC）方法被用于检测病原菌。考虑到传感器性能可靠性的关键作用，各种定量技术已被整合到PEC平台上，以构建双模式传感器。色度传感器表现出直接的色彩响应性，其特性使得无需复杂仪器即可通过肉眼检查。为了消除背景干扰和系统误差，色度方法已被整合到PEC平台上。通过双模式策略，开发了一种基于纳米酶的PEC色度传感器用于检测单核细胞增生李斯特菌，两个系统可以相互参考。因此，活性纳米材料的设计对于高性能PEC色度双模式传感器的发展至关重要。

纳米酶被定义为具有类过氧化物酶催化活性的纳米材料，可用于双模式检测系统以放大信号输出并提高检测灵敏度。TiO₂因其卓越的性能，包括优异的光稳定性、广阔的比表面积和环境兼容性，被广泛认可为主要的光伏材料。然而，TiO₂具有3.0-3.2 eV的宽带隙，使其能够选择性地吸收紫外光，并易于光生电子-空穴对的复合。这一特性显著限制了其实际应用。研究表明，通过将TiO₂与窄带隙半导体结合形成异质结，是提升光催化性能的有效策略。

 本研究中，石墨碳氮化物（g-C₃N₄）因其约2.7 eV的窄带隙和与其兼容的能带结构而被选中。同时，TiO₂和g-C₃N₄具有明显的形成p-n异质结的倾向，从而增强了光生电子-空穴对的分离和传输。基于上述概念，通过在TiO₂/g-C₃N₄上沉积氯化血红素，成功制备了一种新型TiO₂-Fe-N-C纳米酶，旨在增强氧化酶活性（图1A）。所制备的TiO₂-Fe-N-C纳米酶展示了卓越的POD模拟催化活性和光催化性能。为了利用TiO₂-Fe-N-C纳米酶的优异特性，构建了一个基于光电化学比色法的双模式检测平台，用于定量检测单核细胞增生李斯特菌（图1B）。所提出的双识别方法也被用于检测猪肉样品，旨在开发一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的敏感且可靠的检测平台。

图1 TiO₂-Fe-N-C纳米酶制备过程示意图（A）及双模式PEC-比色传感平台的构建（B）。

首先，观测TiO₂-Fe-N-C纳米酶的微观形态。通过透射电子显微镜(TEM)、能量色散X射线光谱(EDS)元素映射以及Zetasizer测试，研究了TiO₂-Fe-N-C纳米酶的形态和尺寸。如图2所示，TiO₂呈现出无序的孔结构（图2A），而g-C₃N₄则显示出了片状、二维的形态特征（图2B）。TiO₂/g-C₃N₄复合材料显示出了层状结构，包含掺杂的球形粒子，从而形成了异质结结构（图2C）。随着血红素氯化物的加入，TiO₂-FeN-C呈现出独特的“葡萄串”形态（图2D）。此外，血红素氯化物中的铁原子与g-C₃N₄中的氮原子以及TiO₂表面的氧原子形成的配位键也对TiO₂-Fe-N-C中“葡萄串”结构的形成做出了贡献。

同时，TiO₂-Fe-N-C颗粒尺寸的减小表明血红素氯化物的加入可以增强TiO₂/g-C₃N₄分布的均匀性（图2E）。此外，TiO₂、g-C₃N₄、TiO₂/g-C₃N₄和TiO₂-Fe-N-C的ζ电位分别测定为- 0.77 ± 0.09 mV、0.24 ± 0.06 mV、- 14.83 ± 0.21 mV 和 - 7.36 ± 0.19 mV（图2F）。TiO₂/g-C₃N₄复合材料的高负ζ电位可以归因于TiO₂的正电荷和g-C₃N₄的负电荷之间的不完全电荷中和。同时，TiO₂-Fe-N-C的ζ电位降低归因于血红素氯化物的加入导致负电荷密度的减少。

图2 （A）二氧化钛的透射电子显微镜图像；（B）g-C₃N₄的透射电子显微镜图像；（C）二氧化钛/g-C₃N₄复合物的透射电子显微镜图像；（D）二氧化钛-铁-氮-碳复合物的透射电子显微镜图像；（E）二氧化钛、g-C₃N₄、二氧化钛/g-C₃N₄复合物以及二氧化钛-铁-氮-碳复合物的颗粒尺寸分布图；（F）二氧化钛、g-C₃N₄、二氧化钛/g-C₃N₄复合物以及二氧化钛-铁-氮-碳复合物的ζ电位图。

研究人员继续进行傅立叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）对TiO₂-Fe-N-C纳米酶的表面官能团和元素组成进行了研究。图3A展示了g-C₃N₄（曲线a）、TiO₂/g-C₃N₄（曲线b）和TiO₂-Fe-N-C（曲线c）的FTIR光谱。TiO₂-Fe-N-C在1228–1631 cm⁻¹和810 cm⁻¹处的峰强降低，这表明了氯化血红素与g-C₃N₄之间的配位作用。

为了进一步表征TiO₂-Fe-N-C纳米酶的元素组成和键合结构，进行了XPS分析。如图3B所示，TiO₂-Fe-N-C纳米酶由C、N、O、Ti和Fe元素组成。在g-C₃N₄（曲线a）、TiO₂/g-C₃N₄（曲线b）和TiO₂-Fe-N-C（曲线c）的C 1s谱（图3C）中，284.51 eV、285.87 eV和288.69 eV处的峰分别与C–C、C–O和NC=N键有关。N 1s谱可以分解为结合能399.63 eV、402.78 eV和406.82 eV处的三个明显成分，分别对应于Fe–N、吡咯N和氧化态-N（图3D）。在O 1s谱（图3E）中，529.67 eV和531.24 eV处的峰对应于晶格氧、羟基氧和物理吸附氧。如图3F所示，在整个反应过程中，Ti 2p_3/2（458.40 eV）和Ti 2p_1/2（464.06 eV）的TiO₂-Fe-N-C的位置和强度保持不变。随着氯化血红素的加入，TiO₂-Fe-N-C的高分辨Fe 2p谱显示出710 eV和723 eV处的两个明显峰，分别对应于Fe 2p_3/2和Fe 2p_1/2（图3G）。上述结果证实了TiO₂-Fe-N-C纳米酶的成功合成。

图3 (A) FTIR光谱,(B) XPS全谱,(C) C1s谱,(D) N1s谱,(E) O1s谱,(F) Ti 2p谱,(G) TiO₂-Fe-N-C纳米酶中的Fe 2p谱,(H) XRD衍射图案。

接下来进行钛氧化铁氮碳纳米酶的酶模拟催化性能实验。为了评估TiO₂-Fe-N-C纳米酶的POD模拟催化活性，使用TMB作为显色剂，在pH 6.0下评估了该纳米酶在HAc-NaAc缓冲溶液(0.01 M)中的催化性能。如图4A所示，在HAc-NaAc缓冲溶液中与TMB和H₂O₂相互作用时，TiO₂-Fe-N-C纳米酶表现出明显的特征吸收峰。同时，可观察到可见的蓝色绿色颜色。在对照实验中，在不含氯化血红素的缓冲溶液中，未观察到吸收峰的显著变化。同样条件下，也没有明显颜色变化。这一现象归因于制备的TiO₂-Fe-N-C纳米酶利用Fe物种催化H₂O₂转化为⋅OH的能力，导致生成oxTMB。为了理解图4A中观察到的颜色变化，通过ESR光谱法研究了反应过程中可能产生的活性氧物种。如图4B所示，动力学数据通过监测30分钟内MB吸光度的变化获得。在不同浓度的H₂O₂溶液（0–5 mM）下观察到吸光度的显著下降。这些结果表明，合成的TiO₂-Fe-N-C纳米酶具有优异的模拟过氧化物酶（POD）的催化性能，能够高效地将H₂O₂转化为·OH。

此外，采用米氏-曼恩稳态动力学评估了TiO₂-Fe-N-C纳米酶的催化性能。在弱酸性条件下，维持TiO₂-Fe-N-C纳米酶浓度不变，H₂O₂浓度范围为0至25 mM。通过监测催化反应体系在650 nm波长处的吸光度变化获取动力学数据。如图4C所示，H₂O₂浓度增加与吸光度呈线性关系。利用比耳-朗伯定律将吸光度变化转化为反应速率，并对H₂O₂浓度进行米氏-曼恩线性拟合（图4D-E）。如图4F所示，采用米氏-曼恩方程的双倒数形式确定Km和Vmax值。TiO₂-Fe-N-C纳米酶的Km值为3.41 mM，Vmax值为1.69×10⁻⁷ M·S⁻¹。TiO₂-Fe-N-C纳米酶的催化效率提升归因于其各组分间的协同效应。上述组分的结合形成了异质结结构，该结构可促进电子-空穴分离并降低复合率。

图4 （A）在pH 7.4的反应缓冲液中，由控制（黑色线条）、H₂O₂（红色线条）、TMB + H₂O₂（蓝色线条）、TMB + H₂O₂ + TiO₂/g-C₃N₄（绿色线条）和TMB + H₂O₂ + TiO₂-Fe-N-C（粉色线条）催化的TMB氧化（oxTMB）的紫外-可见吸收光谱和视觉颜色变化。（B）在1.0 mM H₂O₂下，由TiO₂-Fe-N-C纳米酶降解的MB的紫外-可见吸收光谱。（C）不同浓度H₂O₂（0至25 mM范围）下的吸光度变化。（D）在不同H₂O₂浓度下的吸光度随时间变化。（E）H₂O₂的米氏-门滕动力学分析，相应的（F）林德韦伯-伯克作图。

研究人员继续使用PEC比色双模式检测李斯特菌。光电流测量提供了关键证据，证明了在光照射下产生载流子。如图5A所示，在ITO表面添加g-C₃N₄和hemin氯化物后，光电流显著增加，这归因于光生成载流子的复合减少。与TiO₂-Fe-N-C/ITO相比，BSA/Apt/TiO₂-Fe-N-C/ITO的光电流显著降低。进一步地，由于适配体-细菌复合体的形成，李斯特菌/BSA/Apt/TiO₂-Fe-N-C/ITO的光电流降低，这阻塞了TiO₂-Fe-N-C表面的活性位点。此如图5B所示，TiO₂-Fe-N-C/ITO的圆环半径（曲线d）相比于ITO（曲线a）、g-C₃N₄/ITO（曲线b）以及TiO₂/g-C₃N₄/ITO（曲线c）有所减小，这归因于异质界面间电荷迁移的增强。与TiO₂-Fe-N-C/ITO相比，BSA/Apt/TiO₂-Fe-N-C/ITO的圆环半径（曲线e）增加。这一现象归因于蛋白质层的非导电性，阻碍了界面间电荷转移。此外，当在BSA/Apt/TiO₂-Fe-N-C/ITO表面培养李斯特菌时，电极的阻抗增加（曲线f）。这一过程证实了TiO₂-Fe-N-C和适配体成功地被固定在ITO电极上。

对PEC传感器的响应性进行了评估，方法为测量不同浓度下李斯特菌/BSA/Apt/TiO₂-Fe-NC/ITO电极的光电流强度。随着李斯特菌浓度的增加（从10至10^7 CFU·mL⁻¹），光电流信号逐渐减弱（图5C）。光电流密度与李斯特菌对数浓度之间存在线性关系（图5D）。相应的回归方程为y = −0.0405x + 0.3862，相关系数（R²）为0.9967。通过计算10组结果的标准偏差（σ）进行评估。根据公式LOD = 3σ/K计算检测限（LOD），其中K为校准曲线的斜率。李斯特菌的LOD估计为1.33 CFU·mL⁻¹。同时，对所制备的比色传感器的检测性能进行了评估。如图5E所示，随着李斯特菌浓度的增加，吸光度逐渐降低。该现象归因于李斯特菌浓度的增加掩盖了电极表面TiO₂-Fe-N-C纳米酶的催化活性位点，从而抑制了蓝绿色氧化TMB的形成。比色反应机制涉及两个步骤：H₂O₂分子中的O–O键断裂生成⋅OH，随后⋅OH氧化TMB形成oxTMB。此外，氧化TMB的吸光度与李斯特菌对数浓度之间建立了线性关系，方程为y = −0.0173x + 0.4010（R² = 0.9966）（图5F）。采用相同方法计算李斯特菌的LOD为3.20 CFU·mL⁻¹。

图5 （A）ITO（曲线a）、g-C₃N₄/ITO（曲线b）、TiO₂/g-C₃N₄/ITO（曲线c）、TiO₂-Fe-N-C/ITO（曲线d）、BSA/Apt/TiO₂-Fe-N-C/ITO（曲线e）和单核细胞增生李斯特菌/BSA/Apt/TiO₂-Fe-N-C/ITO（曲线f）的光电流密度，插图显示曲线的放大图，（B）阻抗测试图，（C）不同浓度单核细胞增生李斯特菌（从10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷ CFU·mL^-1）的光电流曲线，（D）单核细胞增生李斯特菌浓度对数值与光电流密度的标准曲线，（E）氧化TMB颜色变化的紫外-可见吸收光谱，（F）单核细胞增生李斯特菌浓度对数值与吸光度的标准曲线。

综上所述，基于光活性TiO₂-Fe-N-C纳米酶，本工作中成功开发了一种PEC-色度双模式传感器，用于检测单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）。合成的TiO₂-Fe-N-C纳米酶表现出显著的光电转换效率和优越的催化性能。基于目标诱导策略，随着李斯特菌浓度的增加，信号响应降低。该PEC-色度传感器能够分别以检出限）.33 CFU⋅mL^{− 1}和3.20 CFU⋅mL^{− 1} 敏感检测目标菌。同时，所开发的双模式传感器表现出优异的选择性、满意的重现性和高稳定性，能够在真实样本中成功应用。总体而言，本工作提供了将所开发的TiO₂-Fe-N-C纳米酶应用于李斯特菌检测的新型视角，作为可行途径。未来研究可以集中于探索其在复杂样本基质中的适用性，以及扩大可检测病原体的范围。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.146508