Chemical Engineering Journal：突破1 CFU极限！基于适配体组功能化CNT-FET生物传感器，实现致病菌实时、超灵敏双重检测

食品安全与卫生是全球公共卫生领域面临的最紧迫挑战之一。大肠杆菌O157（E. coli O157）污染常引发严重腹泻与发热，而单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）则广泛存在于水源和蔬菜中，对免疫力低下人群的致死率高达20%至40%。尽管国际食品法典委员会（CAC）和欧盟（EU）已制定严格标准，且现有的表面增强拉曼散射（SERS）、比色及电化学检测方法在一定程度上简化了程序，但仍存在无法实时检测、靶标单一以及在复杂基质中灵敏度受限等短板。因此，开发一种无标记、能抵抗基质干扰且具备超高灵敏度的双重病原菌检测技术迫在眉睫。

核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选得到的短链核苷酸序列（DNA或RNA）。相比抗体，适配体具有成本低、易合成、稳定性高及亲和力强等优势。传统的单一适配体在面对细菌复杂的细胞表面时，易因位点识别单一而导致假阴性。本研究提出“适配体组”策略，通过组合靶向不同位点的适配体，形成多价结合效应，显著提升了捕获效率和特异性。

场效应晶体管（FET）生物传感器通过栅极耦合将生化相互作用转化为电信号。碳纳米管（CNTs）作为沟道材料，赋予了传感器极高的电子迁移率。本研究首次报道了利用适配体组功能化的CNT-FET传感器实现病原菌的双靶标检测，填补了该领域的技术空白。

本研究开发了一种修饰有双重探针团的CNT-FET功能材料，实现了对大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的高效且高灵敏度的双重检测。使用高纯度CNTs作为源极和漏极之间的半导体通道，并加入额外的Y₂O₃层和SU8钝化层以最小化来自外部复杂环境干扰。检测的特异性不仅与减少装置表面非特异性吸附有关，还与捕获元件的设计紧密相关。利用流式细胞术筛选并组合了针对每种细菌特异性的探针团。这些探针对在单独区域内孵育并通过Au-S键固定，使得在单个微芯片上进行双重靶标检测成为可能。探针团通过其对多目标识别的高度亲和力和识别能力进一步改善了传感器的检测性能。除了在缓冲溶液中（单细胞检测水平）进行测试外，还评估了复杂样品基质（例如水产品、家禽、鸡蛋和蔬菜）对传感器性能的影响。检测极限约为1 CFU，目标细菌可以在无需复杂富集、标记或检测步骤的情况下，实时检测200秒内。单盲测试的准确率为100%。结果表明，该传感器在实际环境中具有有效性，突显了其在快速、高灵敏检测食品中细菌的巨大潜力（图1）。

图1 该双重适体组改性碳纳米管场效应晶体管生物传感器同时检测大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的示意图。 

首先，进行CNT-FET生物传感器的制备与表征。具有共享源极和独立漏极的多通道设计展示了集成和多重化的便捷性，允许同时检测多个生物靶标，如图2A所示。光学显微镜显示传感器通道尺寸为40×20μm。中央通道连接电极，密集地填充着均匀的CNT网络，在扫描电子显微镜（SEM）下可见，如图2B所示。均匀地沉积在Y₂O₃薄膜上的金纳米颗粒（AuNPs）是连接识别元素的重要基础，在图2C中均匀分布。源极和漏极金属接触用SU8光刻胶钝化，以防止电流泄漏和不稳定的电化学反应，从而确保传感器的稳定性。图2D展示了适配体组分的功能化和细菌检测的示意图。

通过扫描栅极电压（Vgs）和漏极电流（Ids）测量了50个未改性的碳纳米管场效应晶体管（CNT-FETs）的电性能，并将漏极电压（Vds）设定为-0.1 V，以获得电传输曲线。随后，采用X射线光电子能谱（XPS）评估了双功能化的成功程度。图2E和2F分别展示了大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的测试区域的检测结果。在细菌培养后，氮含量进一步显著升高，表明富氮的细菌细胞（富含蛋白质）被适配体成功捕获在器件表面。

此外，对芯片上固定后的Cy3标记的适配子进行了观察。如图2G所示，仅在AuNP涂覆的通道区域观察到荧光，进一步证实了适配子修饰的成功。图2H和2I中的通道SEM图像显示了成功捕获并附着到传感器上对应通道的杆状大肠杆菌O157和单增李斯特菌。目标细菌的存在证明了双适配子组修饰的有效性，强调了该传感器在准确可靠检测食源性病原体方面的潜力。

图2 功能化与碳纳米管场效应晶体管生物传感器对大肠杆菌O157和单核细胞李斯特菌的联合表征。A. 传感器阵列的光学显微镜图像（标尺：100 μm）和单个器件图像（标尺：10 μm）。B. 通道区域的扫描电镜图像，显示3-5 nm金纳米粒子的均匀分布（标尺：200 nm）。C. 碳纳米管网络的扫描电镜图像（标尺：200 nm）。D. 适配体组功能化和细菌检测的示意图。E-F. 大肠杆菌和单核细胞李斯特菌检测通道中硫（S）和氮（N）元素的X射线光电子能谱扫描。G. 通道中标记有Cy3荧光染料的适配体组荧光显微镜图像（标尺：40 μm）。H-I. 通过通道表面的适配体捕获的大肠杆菌O157和单核细胞李斯特菌的扫描电镜图像（标尺：2 μm）。

研究人员继续进行大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌两种适配体组合的亲和力评估，获得了多种能够识别大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌不同结合位点的适体。这些适体被组合并排列用于初步筛选，通过流式细胞术得到一组表现出最高荧光信号的适体，如图3B和3C所示。这表明成功地鉴定出一种能够更有效地响应靶标的适体组合。如图3A所示，适体与复杂靶标上的多个不同位点结合，增强了累积效应，同时减少了当单个适体结合到同一位点时可能发生的潜在竞争性结合或位阻效应。

此外，利用四种非靶标细菌测试了混合和个体适配体的特异性，结果展示于图3D。混合适配体对于干扰细菌的荧光强度几乎完全源自细胞本身的固有荧光，显著增强了非靶标特异性，同时也提高了对靶标细菌的识别。

为了研究结合大肠杆菌O157和李斯特菌后，适配体组的二级结构构象变化，进行了圆二色谱（CD）分析，结果如图3E所示。当靶细菌与其相应的适配体相互作用时，280 nm处的正峰向下移动，并且当多个适配体与靶细菌结合时，这种变化进一步放大。此外，负峰也显示出明显的降低。吸收峰的显著变化表明适配体组合的结构变化更加显著，这为间接证据表明组合中的三个适配体可以同时结合到细菌上提供了支持。

为了可视化适配子组与细菌细胞表面的结合，采用了共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）来分析相互作用。适配子组通过三种独特的荧光标记（大肠杆菌-适配子1@FAM，大肠杆菌-适配子2@Cy5，以及大肠杆菌-适配子3@Cy3用于大肠杆菌；单增李斯特菌-适配子1@FAM，单增李斯特菌-适配子2@Cy5，以及单增李斯特菌-适配子3@Cy3用于单增李斯特菌），结果如图3F所示。共聚焦激光扫描显微镜图像中的三个荧光通道对应的荧光信号的同步观察，直接证明了适配子组与目标细菌的结合。

图3 评估混合适配子的亲和力和特异性。A. 细菌表面适配子组的多价结合示意图。BC. 通过各自的适配子组与大肠杆菌O157和单增李斯特菌结合产生的荧光强度。D. 利用流式细胞术检查大肠杆菌O157和单增李斯特菌的适配子组的特异性。E. 在结合前后，大肠杆菌O157和单增李斯特菌的适配子组的光谱变化。F. 利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示大肠杆菌O157和单增李斯特菌与其各自适配子组（apt1@FAM, apt2@Cy5, apt3@Cy3）结合的图像（比例尺：2 μm）。

在确认了混合适配子的结合成功以及传感器的功能性之后，对使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液作为目标细菌的双重多适配子组合修饰CNT-FET生物传感器的传感行为进行了研究，如图4A所示。目标分析物与适配子之间的相互作用导致适配子采用更卷曲的二级结构，其中更多部分位于德拜长度内。这减少了电荷屏蔽效应，并将大量负电荷带到了传感通道附近，导致空穴载流子数量增加，最终导致漏电流（Ids）增加。当使用缺乏适配子功能化的传感器进行测量时，未观察到电流显著变化，进一步证实了电流增加直接与适配子捕获效应相关。

接下来，采用静态检测方法评估了生物传感器对两种目标细菌的敏感性。通过将不同细菌浓度的细菌与传感器孵育，测量了转移特性（图 4B 和 4C）。传感器的电流响应（ΔIds）定义为 ΔIds = Ids − Ids0，其中每个响应由三个传感器记录。如图 4C 所示，在门电压（Vgs）=-0.7 V 和漏极电压（Vds）=-0.1 V 下，漏极电流响应随着对数浓度线性增加。通过将线性拟合线的交点与三倍信噪比线相交，得到了大肠杆菌 O157 的静态检测限为 50.23 CFU mL⁻¹ 和单核细胞李斯特菌的检测限为 56.04 CFU mL⁻¹。因此，这两种细菌的检测限均低至约 1 CFU，实现了在 20 μL 样品体积内的单细胞敏感性。

这些结果表明，抗体组功能化的CNT-FET生物传感器双靶点检测系统具备超敏感单细胞检测能力。通过利用多位点识别的协同效应促进目标结合和捕获，可以诱导空间构象变化，显著增强信号强度和稳定性（图4D）。随后，使用静态检测验证了测试的准确性，以评估该方法的专一性。除了用作非特异性细菌的大肠杆菌O157和李斯特菌，还测试了四种干扰细菌。如图4E和4F所示，浓度为10⁴ CFU/mL的目标细菌产生了显著更高的响应，而非特异性细菌浓度高出一个数量级仅引起微小电流变化。包含目标细菌的混合细菌溶液也产生相对较高的响应，但与纯细菌溶液的响应差异非常微妙。这些差异在统计学上具有显著性，表明该检测方法具有可靠的区分能力。

图4 A. 在混合适体功能化后，传感器与大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌结合时电流传递曲线的变化。所有测量均在0.01 × PBS缓冲液中，Vds = -0.1 V条件下进行。B. 大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌在不同浓度（80–524880 CFU mL⁻¹）下的传递曲线。C. 传感器对目标分析物不同浓度（80–174960 CFU mL⁻¹）引起的电流响应值（n ≥ 3），虚线表示在0.01 × PBS、Vds = -0.1 V和Vgs = -0.7 V条件下的三重信噪比测量。D. 混合适体与目标细菌结合前后结构变化的示意图。E-F. 与目标细菌产生的响应相比，空白对照组和五种非目标细菌引起的电流变化（Vds = -0.1 V，Vgs = -0.7 V）。***p < 0.001（高度显著），数据以平均值 ± 标准差表示。G. 生物传感器在Vds = -0.1 V和Vgs = -0.15 V条件下对不同浓度（240–174960 CFU mL⁻¹）的大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌产生的实时电流响应。

研究人员还评估了基于抗体的CNT-FET双检测生物传感器在快速检测真实食品样本中两种目标细菌的适用性，重点是水产品，由于复杂的水环境，水产品容易受到细菌污染。对水产品（虹鳟鱼、鲶鱼、虾）进行匀浆，并用PBS稀释至五个浓度梯度，在Vgs = -0.15 V下进行跟踪检测的结果如图5A-C所示。测试表明，作为空白对照的样品矩阵仅引起微小的电流变化，而受污染的样品导致电流显著增加，表明测试结果为阳性。电流在200秒内稳定，这种高效率使得能够检测到食品样本中的细菌污染，最低为1.8 CFUs。在实时检测中，活的和移动的细菌的存在影响了抗体的结合能力，需要更多的“触须”来固定大型细菌细胞在通道表面上。通过使用多个抗体和多点捕获，减少了活细菌移动引起的干扰，导致更高的和更稳定的电流响应，满足了现场检测的要求。

为了验证设备在不同食品基质中的可行性，还对鸡蛋、猪肉、生菜和海带这四种食品样本中人工污染的两种目标细菌进行了实时监控。图5D-G展示了在这四种食品基质中检测大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的情况。未污染的匀浆的添加导致了轻微的电流波动，这是实际样本中离子环境固有复杂性导致的，但这些波动是可控的，并逐渐稳定。在三个独立样品的设备上重复了实验，嵌入的部分代表重复测量的电流响应值。这些结果突显了基于碳的生物传感器在实时、敏感和特异性检测各种食品类型中的大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌方面的优势。能够立即识别多种细菌标志着食品安全监控领域的重要进展，可能简化了病原体检测流程，并为开发手持便携诊断工具以减轻食物中毒爆发风险奠定了基础。

图5 使用适配体组功能化的碳纳米管场效应晶体管生物传感器对多种受污染食品样品中大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的实时检测。A-C. 使用该传感器对鲶鱼、虹鳟鱼和虾样品中大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的多浓度梯度进行实时检测（Vds = -0.1 V，Vgs = -0.15 V）。D-G. 在相同条件下（Vds = -0.1 V，Vgs = -0.15 V）对鸡蛋、猪肉、生菜和裙带菜样品中大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的实时检测与响应值分析（n ≥ 3）。

综上所述，本研究成功开发了一种负载适配体组的碳纳米管场效应晶体管（CNT-FET）生物传感器。通过高纯度半导体材料与“多重捕获”适配体策略的结合，该器件在兼顾高特异性的同时，实现了对大肠杆菌O157和单核细胞增生李斯特菌的超灵敏（~1 CFU）和快速（<200 s）检测。该技术无需复杂的样本富集或标记步骤，为食品安全领域的现场即时检测及便携式诊断工具的开发提供了强有力的技术支撑。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.161218