早期准确识别儿童感染病毒，有利于个性化医疗和管理，减少未来严重症状的发生。因此，开发一种高通量多重实时RT-PCR方法以提高常规临床实验室检测的准确性和效率至关重要。

  2022年发表在《Virology Journal》上的《Multiplex detection of eight different viral enteropathogens in clinical samples, combining RT-PCR technology with melting curve analysis》一文介绍了建立一种实时RT-PCR结合熔融曲线分析法(RRCMC)同时检测轮状病毒a、b、c、诺如病毒GI和GII、腺病毒、星状病毒和札幌病毒的方法。

  病毒感染是5岁以下儿童急性腹泻的最常见原因之一。病毒性腹泻的病原体包括轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒和萨波病毒。

  在中国，抗原测定是许多医院快速筛查某些病毒的主要工具。然而，这种技术是不敏感的和交叉反应的。由于抗体产生的时间窗，其对早期诊断的用处不大。此外，抗原和抗体检测并不适用于多种腹泻病毒。核酸检测因其灵敏度高、特异性强、诊断早而被广泛应用。

  目前，临床核酸诊断多基于腹泻相关病毒的DNA / RNA检测。然而，由于荧光染料和标记探针数量的限制，不能在一管检测溶液中检测到更多的病原体。以往的研究开发了多种PCR检测方法，具有多种检测功能。然而，这些方法要么不是实时检测，要么不是高通量，这对需要高效率和生产率的实验室来说是一个挑战。

  RRCMC检测的原理在先前的研究中报道:在每个荧光通道中，设计4个探针，用相同的荧光染料和8个引物标记4种病毒(每个探针的长度不一致)，用FAM探针检测轮状病毒c、星状病毒、轮状病毒b和诺如病毒GI，用VIC探针检测轮状病毒a、萨波病毒、诺如病毒GII和腺病毒。

  图为RRCMC法的扩增及熔化曲线。FAM通道检测轮状病毒c、星状病毒、轮状病毒b和诺如病毒GI，并通过熔化曲线的温度位置(蓝色熔化曲线为阴性对照，黑色熔化曲线为样品)对每种病毒进行确认。B通过VIC通道检测轮状病毒a、札幌病毒、诺如病毒GII和腺病毒，并通过熔化曲线的温度位置(绿色熔化曲线为阴性对照，黑色熔化曲线为样品)对每种病毒进行确认。扩增曲线:纵坐标为荧光值，横坐标为周期数;熔化曲线:纵坐标为荧光值，横坐标为温度。

  采用RRCMC法对收集的160例急性腹泻患儿粪便标本进行检测。71例患者诺如病毒、腺病毒或轮状病毒检测呈阳性。RRCMC检测具有高特异性。8种腹泻病毒之间无内部交叉反应，其他常见肠道病原菌与人类基因组无交叉反应。每种腹泻病毒的检出限为1 × 10² ~ 1 × 10⁵个核酸拷贝/毫升。

  RRCMC方法具有高通量、低成本、高灵敏度、高特异性等优点，是一种适用于感染性病毒的临床快速检测方法。

  参考文献：Li W, Li W, Li L, et al. Multiplex detection of eight different viral enteropathogens in clinical samples, combining RT-PCR technology with melting curve analysis[J]. Virology Journal, 2022, 19(1): 1-7.