27分钟出结果！RPA双读卡现场守护食品安全

食源性病原体污染是全球食品污染事件的重要来源，严重影响全球食品供应链和消费者健康。沙门氏菌作为一种分布广泛、传播迅速的主要全球健康问题，通常通过多种受污染食品（特别是肉类、乳制品和未充分加工的蔬菜）传播给人体。毒理学研究证实，沙门氏菌及其潜在代谢副产物对人类肠道、血液和肝脏有害，可导致一系列严重疾病。这使得快速准确检测沙门氏菌成为控制食源性疾病传播的关键步骤。

传统微生物检测策略基于培养、形态观察和生化分析，虽然被广泛应用作为标准沙门氏菌检测方法，但存在灵敏度低、效率差的局限性，且对突变菌株和罕见菌株的识别能力较弱。近年来，分子生物学技术推动了微生物检测策略的进步，其中等温核酸扩增（INA）技术因能在现场检测和复杂基质环境中提供超灵敏结果而获得快速采用。INA技术保持稳定恒定的反应环境，无需复杂温控模块和精密仪器，显著缩短检测时间。

侧向流动测定（LFA）因其简单、快速和低成本的优势，成为传统病原体检测方法的有效替代方案。然而，单一INA和LFA技术各有局限，需要开发新型INA/LFA传感器来协调各自优势。虽然已有研究将LAMP等INA技术与LFA集成检测沙门氏菌，但这些方法依赖复杂的引物设计，且反应温度通常超过60℃，在POCT应用中存在限制。RPA作为一种新兴INA技术，具有引物设计简单、不受靶基因模板限制的特点，能在室温下快速扩增特定核酸片段，显示出与LFA集成的理想潜力。本研究基于沙门氏菌特异性保守序列fimY基因，创新性地开发了便携式双模式RPA-LFA传感器，为食源性病原体检测提供了新的技术方案。

研究内容

图1. 用于沙门氏菌荧光和比色检测的便携式rpa LFA传感器示意图。

本节阐述了基于RPA的比色-荧光双模式LFA检测沙门氏菌的工作原理。在基因富集阶段，沙门氏菌经超声裂解获得完整基因组，针对fimY基因保守序列设计的正向和反向引物分别在5'端标记生物素和FAM基团。RPA反应在室温下15分钟内快速富集特定保守序列，每个双链DNA扩增产物两端均含生物素和FAM基团。测试条组装时，C线负载山羊抗兔二抗，T线固定链霉亲和素（SAV），样品垫预载AuNPs@FAM抗体探针。目标菌存在时，FAM基团与抗体探针结合向前流动，生物素基团被T线SAV捕获，形成三明治复合物显示阳性结果。

图2. 可行性示意图。

基于沙门氏菌特异性fimY基因，通过序列比对确定高度保守片段，设计了7对RPA引物（P-1至P-7）。所有引物设计遵循扩增产物130-150 bp、引物长度30-35 bp、GC含量35%-65%的原则。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，P-3引物扩增效率最高，产物强度明显优于其他引物，因此选择P-3用于后续实验。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证RPA反应系统可行性，结果显示重组酶和聚合酶均为RPA反应不可或缺的组分。UV吸收光谱和Zeta电位分析证实AuNPs与FAM抗体成功偶联，吸收峰从527 nm红移至535 nm，Zeta电位从-27.08 mV增至-18.95 mV。实际可视化结果验证了实验设计的可行性，阳性样品在比色和荧光模式下均显示明确信号。

图3. 反应条件优化。

系统优化了检测条件参数，包括胶体金pH值、封闭剂类型、抗体浓度、SAV浓度和观察时间。结果表明，8μL K2CO3为最佳pH调节体积，BSA表现出最优封闭效果，2 mg/mL抗体浓度和1 mg/mL SAV浓度可获得最佳信号强度，10分钟为最佳观察时间。

图4. 便携式LFA试纸条对沙门氏菌的检测性能。

在最优条件下，比色模式检测限为10 cfu/mL，线性范围10^2-10^6 cfu/mL（R²=0.9986）；荧光模式检测限达1 cfu/mL，线性范围10^0-10^6 cfu/mL（R²=0.9981）。与平板计数法结果对比显示无显著差异，传感器在20天储存期内保持良好稳定性。

本研究成功构建了比色-荧光双模式流动色谱测试条传感器，实现了对牛奶和生菜样品中沙门氏菌的超灵敏检测。该传感器基于AuNPs-FAM抗体合成和fimY基因片段RPA富集，通过智能手机捕获T线信号，在10分钟内实现沙门氏菌快速双模式检测，比色和荧光模式检测限分别为10 cfu/mL和1 cfu/mL，线性范围10^1-10^6 cfu/mL。该方法具有便携性、高灵敏度、适合非专业用户、成本效益高和室温检测等优势，完美契合POCT需求。通过匹配相应保守序列和引物设计，该方法可扩展到更广泛食源性病原体检测。未来通过便携观察设备减少信号采集误差，将核酸提取和富集过程集成到微流控芯片等便携反应器中，有望使该技术在复杂实际场景中得到更广泛应用。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.144058