用“细胞完整性”做药敏：一个可直接测临床样本的CRE快速方案

原创

来源：邹晶晶

2026-01-09 15:20:32

337次浏览

核心提示：华南理工大学医学院第二附属医院检验医学科刘大渔团队提出一种基于细胞完整性变化的CRE快速药敏（Baci-PmT）：在低渗体系中加入美罗培南与DNase，使碳青霉烯敏感菌细胞完整性受损后DNA外泄并被降解，再用多重ddPCR定量处理组/对照组DNA比值λ，并将λ首次达到判据对应的药物浓度定义为MIC，从而在3–4.5小时内同时完成物种识别、CRE表型判定与MIC测定。

碳青霉烯类抗生素是重症细菌感染的重要药物，但其使用增加推动了碳青霉烯耐药肠杆菌目（CRE）流行。CRE治疗选择有限，且有效治疗延迟与较高死亡率相关，WHO已将其列为高优先级病原体；临床因此需要尽早识别CRE，并根据碳青霉烯酶类型优化用药。现有检测主要分为基因型与表型两类。基因型检测通过耐药基因推断耐药并提示酶型，数小时可出结果，但只能覆盖已知基因，基因存在与耐药表型并不总一致，同时无法提供MIC，限制了药物选择。表型检测直接评估细菌对药物的反应，更贴近真实敏感性，但传统流程通常需分离培养、筛查与确认，整体耗时2至3天；部分新型快速表型方法虽缩短培养步骤，却往往难以同时给出菌种与酶型信息，并可能受样本中非目标菌干扰。近年来pheno-molecular思路尝试用短时药物暴露后的核酸变化反映表型，但对碳青霉烯这类主要作用于细胞壁的药物，短时暴露不一定产生可观的“核酸复制差异”，从而限制了速度与稳定性。

基于此背景，华南理工大学医学院第二附属医院检验医学科刘大渔团队提出了Baci-PmT，将“细胞完整性变化”作为更直接、可快速放大的表型读数（图1）：在低渗培养体系中加入碳青霉烯类药物（以美罗培南，MEM为例）后，敏感菌细胞壁被削弱，因此更容易出现膜通透性升高与DNA外泄（图2）；同时加入DNase可降解外泄DNA，使“外泄出来的DNA”在体系内被主动清除，从而把“敏感菌更易受损”的差异在短时间内放大为“可提取DNA量显著下降”的分子信号。随后通过mddPCR同时完成物种核酸定性与DNA绝对定量，并计算处理组/对照组DNA比值λ：当MEM浓度升高到足以造成完整性受损时，λ会出现明确下降，据此既可快速区分CRE与CSE，也可将λ首次达到判据的MEM浓度定义为MIC。为提高实用性与并行能力，该平台采用颜色+空间分辨的mddPCR设计，支持在同一轮实验中并行处理不同药物浓度与抑制剂条件，从而输出“物种识别+CRE表型+MIC+酶型”等高信息量结果。

研究主要聚焦临床关注的4种肠杆菌：大肠埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）和弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）。作者首先围绕培养体系进行建立与优化（图3），验证“低渗+MEM”可促使敏感株更明显DNA外泄，并进一步证明加入DNase后才能稳定拉开处理组与对照组DNA差异，最终确定HOC-DNase（2 μg/mL MEM，20% MHII）及30 min暴露即可在上述菌种中稳定区分敏感与耐药。随后进入关键的临床验证（图4）：在52株临床分离株中，Baci-PmT对CRE表型识别的敏感性与特异性均为100%（31/31与21/21），且MIC与肉汤微量稀释法（BMD）在允许误差范围内一致（31/31）。进一步在51份临床原始标本（38份尿液、13份BALF，含3份多菌感染）中，Baci-PmT对CRE表型检测的敏感性为100%（24/24）、特异性为93.1%（27/29），且CRE样本的MIC与BMD一致性为100%（24/24），从而为“可直接测临床样本并给出MIC”提供了关键证据。

总的来说，Baci-PmT以低渗条件放大美罗培南对敏感菌细胞壁的作用，并用DNase将DNA外泄差异稳定地转化为可定量的λ变化，从而在数小时内完成CRE表型判定与MIC测定并可结合抑制剂推断酶型；其并行检测依托两条思路，多菌种多重：用“颜色分辨”，以4种荧光探针对4种目标菌实现同管定性与定量，多条件多重：用“空间分辨”，将不同MEM浓度与抑制剂条件样本分配至不同ddPCR单元同步运行以获得完整判读信息；需要注意的是，尽管药物暴露仅30 min，ddPCR分析（~2 h）仍相对耗时且高MIC样本（≥32 μg/mL）可能需二轮检测，流程仍包含富集与提取等离线步骤，临床样本中酶型判定一致性亦存在下降空间。

图1 Baci-PmT的检测原理与操作流程示意图。（A）Baci-PmT在低渗培养体系中加入MEM与DNase：CSE因细胞完整性受损发生DNA外泄并被DNase降解，而CRE不出现明显的DNA外泄/降解。（BC：基础培养体系；Baci-PmTC：Baci-PmT培养体系）。（B）操作流程：将细菌悬液加入Baci-PmT培养体系孵育后进行DNA提取；用具颜色与空间分辨的多重ddPCR（mddPCR）进行定量；根据定性结果鉴定菌种，并依据定量结果判定CRE表型及碳青霉烯酶类型。

图2 MEM与低渗条件对CS-Eco与CR-Eco形态的影响（显微图）。

图3 Baci-PmT培养体系的建立与关键条件优化。（A–B）在含2 μg/mL MEM条件下，将CS-Eco与CR-Eco分别在基础培养体系（BC）与低渗培养体系（HOC）孵育30 min；离心后统计细菌核酸在上清（SN）与沉淀重悬（PR）中的比例。（C-D）在同样含2 μg/mL MEM条件下，比对HOC与HOC-DNase两体系中（MHII含量为20%、50%、80%）CS-Eco与CR-Eco的λ值变化。（E）在HOC-DNase（2 μg/mL MEM，20% MHII）中，测定4种常见CRE相关菌在不同孵育时间下的λ值。