双温核壳滴：90分钟RAA-CRISPR药敏速判

抗生素耐药性已经成为全球公共卫生的重大威胁。传统的表型药敏检测（AST）依赖于24至48小时的肉汤微量稀释法，这种方法会导致诊断延迟，进而引发经验性用药，进一步加剧耐药性传播。近年来，虽然基于耐药基因的分子检测能够缩短检测时间，但其结果与表型耐药性常常不一致，且在不同病原体中的适用性有限。因此，迫切需要开发一种快速、准确且广泛适用的表型药敏新技术。本研究为满足这一需求，构建了一种温度响应型核壳微滴平台（SEE-phAST）。该平台采用液滴微流控技术，通过明胶和PEG的密度差异，构建了核壳结构的微滴。重组酶扩增（RAA）试剂被封装在明胶相中，而CRISPR/Cas12a试剂则被封装在PEG相中。利用温度控制引导相态分离，微滴内的RAA和CRISPR反应得以按序进行。在抗生素暴露下，细菌的基因拷贝数（CNVs）会发生变化，而通过此平台的温度响应特性，能够精确地检测这些变化，进而实现细菌的抗生素敏感性分析（图1）。这一方法不仅能有效提升检测灵敏度，还能够在短时间窗内区分抗药性和敏感性菌株，为快速准确的表型药敏检测提供了新思路。

本研究的药敏判定策略是：用“短时抗生素暴露前后（或相对起始T0）的细菌基因组DNA拷贝数增长倍数（fold change）”作为表型指标：若在抗生素条件下拷贝数增长与对照相当则判耐药（R），若增长显著受抑则判敏感（S）。基于此，作者首先针对临床UTI相关分离株：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌及其临床常用抗生素组合开展短时暴露实验。在0 min与30 min两个时间点分别提取gDNA，并在SEE微载体内顺序完成RAA预扩增与CRISPR/Cas12a荧光读出；通过共聚焦成像统计“明亮液滴”占比，进一步计算相对T0的fold change。结果显示，对照组在30 min内出现可观的拷贝数增长，而敏感株在含药条件下增长显著受抑，耐药株则与对照接近（图2）。进一步地，作者将微载体生成、停靠富集、恒温孵育与荧光成像集成于COC芯片，通过U形柱阵列约束微载体簇并保证芯片内读出稳定；在多重检测方面，为不同病原配置不同荧光通道，并采用“分别乳化后pooling”的策略实现同场并行读出，同时比较RAA与CRISPR在明胶相与PEG相的不同布置方式对信号输出的影响，从而展示多通道信号可独立调控及面板化拓展潜力（图3）。

总体而言，本研究以温敏、空间封装的SEE乳液微载体为核心，把RAA预扩增与Cas12介导的信号转导顺序整合在同一隔室内运行，相比传统液滴CRISPR“单分子直接触发读出”的模式，通过先指数级抬升拷贝数再读出，实现更快速且更稳健的数字化可计数荧光信号生成，从而为“短时抗生素暴露引起的DNA拷贝数增长差异”提供了可量化、可工程化的表型药敏读出路径。不过，值得关注的是，这篇文章提出的多重策略：各菌-探针体系分别乳化后再pooling，虽然能够规避Cas12a旁切带来的体系内空间特异性不足，实现可扩展并行检测，但该多重验证属于“分别乳化后合并孵育与读出”的并行通道展示，并未在同一份混合感染真实样本上完成物种分辨的AST/ID验证。同时，当前验证仍主要依赖实验室加标样本而非真实临床标本，且病原与抗生素面板覆盖有限，这使其临床通用性与对复杂样本的适配性仍待系统评估。未来仍需将大规模临床验证、扩展病原与耐药标志物、集成自动化样本前处理与便携读出设备，以及核酸条形码等更强多重方案作为下一步关键方向，决定该平台能否从概念验证走向真实诊断应用。

图1  SEE-phAST工作流程示意图。通过构建SEE微载体，并将其用于顺序执行RAA预扩增与CRISPR/Cas12a液滴数字检测（ddCRISPR），实现细菌感染的快速AST。

图2  基于SEE微载体的临床UTI细菌数字化AST单分子扩增与荧光读出。（A）从样本到结果的检测流程；（B、E、F）SEE微载体顺序反应后，在三种抗生素有或无条件下对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的共聚焦荧光检测图像；（C、G、H）统计0与30 min抗生素孵育时明亮液滴比例；（D）以“肺炎克雷伯菌–头孢他啶”为例，比较不同暴露时间下明亮液滴比例的倍数变化；比例尺：B、E、F 为100 μm。

图3  集成微流控芯片上的多重病原检测。（A）集成芯片可完成微载体制备、芯片内密集堆积、恒温孵育与荧光成像；（B）停靠腔的关键结构为U形柱阵列，用于有效约束微载体簇；（C）反应后在芯片内以明场和荧光模式对微载体进行表征，验证流程稳定性；（D）多重检测模式，上两行采用RAA在明胶相、CRISPR在PEG相，下两行交换两相；2:1与1:1为FAM与Cy3标记微滴总数比例的示例；（E）该配置可独立且同步调控Cy5-Kleb、Cy3-PA与FAM-E. coli的荧光信号；比例尺100 μm。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117937