基于 LAMP 技术的家禽弯曲杆菌快速检测研究

1.引言

弯曲杆菌是人类急性细菌性胃肠炎的首要致病菌，超过 60% 的英国零售新鲜鸡肉存在该菌污染，高浓度污染（>1000 CFU/g）占比达 11%，对公共健康构成严重威胁。

传统检测依赖培养法，需 3-4 天且需专业实验室支持，无法满足食品供应链实时监测需求；现有快速检测方法（如 PCR、抗体检测）多需 DNA 提取或富集步骤，难以现场部署。

已有的 LAMP 检测试剂盒仍需预富集和复杂离心操作，检测周期长达 23.5-25.5 小时，缺乏真正适用于现场快速筛查的简便方法，亟需优化无需富集、直接检测的技术方案。

（一）实验材料准备

菌株与培养：选用空肠弯曲杆菌（NCTC 11168）和大肠弯曲杆菌（NCTC 11350），在 41.5±1℃微需氧条件下（5% O₂、10% CO₂、85% N₂）培养 48 小时。

样本类型：包括家禽屠体海绵拭子（鸡、火鸡）、禽舍靴拭子，部分样本经 SonoSteam®（蒸汽 + 超声）处理用于评估去污效果。

（二）样本预处理流程

屠体拭子：将预湿拭子反复按压洗脱，取 500μl 洗脱液 85℃加热 5 分钟，直接取 5μl 作为 LAMP 反应模板，无需 DNA 纯化。

靴拭子：用 100mL PBST 缓冲液重悬后振荡 30 秒，四倍稀释后与等体积 0.3M KOH 混合，85℃加热 5 分钟，取 5μl 用于反应。

（三）LAMP 检测体系优化

靶向基因：选择嗜热弯曲杆菌属 16S rRNA 基因序列设计引物，包括 FIP、BIP 等特异性引物（表 1）。

内部扩增对照（IAC）：设计退火温度（92.5℃）与目标扩增子（88℃）差异显著的 IAC 序列（图 1），终浓度 340 拷贝 / 反应，排除扩增抑制剂导致的假阴性。

反应条件：使用 ISO-004 等温反应混合物，65℃恒温反应 60 分钟，后续经 98℃加热后以 0.05℃/ 秒冷却至 80℃，通过退火曲线分析结果。

（四）方法验证方案

人工污染实验：向无菌火鸡拭子添加不同浓度（10¹-10⁵ CFU / 拭子）的弯曲杆菌，验证检测限。

平行对比实验：171 份自然污染屠体拭子、若干靴拭子分别用优化 LAMP 法与传统培养计数法（基于 ISO/TS 10272 标准）检测，对比一致性。

2.结果与讨论

（一）IAC 与检测限性能

IAC 特异性良好：退火曲线中 IAC 峰值（92.5℃）与目标峰值（88℃）清晰区分，阴性样本仅出现 IAC 单一峰值（图 2），有效监控扩增有效性。

检测限明确：人工污染样本中，该方法可稳定检测到 10⁴ CFU / 拭子，部分实验中可低至 10³ CFU / 拭子；自然污染样本中，≥800 CFU / 拭子的样本检测阳性率达 100%。

（二）自然污染样本检测结果

屠体拭子：70 份培养法阴性（≤10 CFU / 拭子）样本中，LAMP 法仅 1 份假阳性（阳性率 1.4%）；400-760 CFU / 拭子样本阳性率 45.4%，随细菌浓度降低阳性率逐渐下降（表 3）。

靴拭子：可检测到≥30 CFU/g 的污染，与培养法结果趋势一致，适用于禽舍环境监测（表 5）。

SonoSteam® 处理评估：处理前阳性鸡群样本 LAMP 检测全为阳性，处理后 15 份样本中 14 份阴性，与培养法结果相符，可用于去污效果监测（表 4）。

（三）方法适用性

无需富集与 DNA 纯化，仅需热块和便携式仪器，1 小时内出结果，可在农场、屠宰场、零售端等现场部署。

耐受复杂基质干扰，对含粪便、垫料等杂质的靴拭子仍有效，且可拓展至牛屠体等其他样本类型。

图 1：内部扩增对照（IAC）DNA 序列

核心作用：作为扩增过程的内参，验证反应体系是否受抑制剂干扰。

设计特点：序列经优化后，退火温度与目标基因差异显著（4.5℃），确保在退火曲线中可明确区分，避免与目标信号混淆。

图 2：LAMP 扩增后退火曲线

曲线解读：横坐标为温度，纵坐标为荧光信号变化率，不同曲线对应不同样本类型。

关键信息：阳性对照（纯化弯曲杆菌 DNA）出现双峰值（88℃目标峰 + 92.5℃ IAC 峰）；污染样本（18 号）同样显示双峰值；阴性样本（17 号）和空白对照仅出现 92.5℃ IAC 峰，直观区分样本污染状态。

表 1：弯曲杆菌 LAMP 引物序列与浓度

内容说明：列出 6 种特异性引物的序列、终浓度及参考来源，包括正向 / 反向内引物（FIP/BIP）、环引物（F-Loop/B-Loop）等。

应用价值：引物组合靶向 16S rRNA 基因，确保检测特异性，各引物浓度经优化后平衡扩增效率与特异性。

表 2：人工污染拭子的 LAMP 检测结果

数据逻辑：横向为污染浓度（10¹-10⁵ CFU / 拭子），纵向为阳性样本数 / 检测样本数。

核心结论：10⁴ CFU / 拭子及以上浓度时，检测阳性率 100%；10³ CFU / 拭子阳性率 40%；10² CFU / 拭子及以下均为阴性，明确方法检测下限。

表 3-5：自然污染样本检测对比表

表 3（屠体拭子）：按培养法计数分组，呈现不同浓度区间的 LAMP 阳性率，体现浓度与阳性率的相关性。

表 4（SonoSteam® 处理样本）：对比处理前后 LAMP 与培养法结果，验证方法对去污效果的监测能力，处理后阳性率显著下降。

表 5（靴拭子）：小样本验证显示，LAMP 法可检测≥30 CFU/g 的污染，适用于禽舍环境污染筛查。

4.总体结论

该研究成功开发了一种快速、简便的 LAMP 检测方法，无需富集培养和 DNA 纯化步骤，结合 IAC 有效避免假阴性，1 小时内即可完成家禽样本中弯曲杆菌的检测。其检测性能与传统培养法高度一致，可稳定识别高浓度污染（≥800 CFU / 拭子），适用于家禽生产全链条的现场筛查，能帮助快速评估生物安全措施效果、监控去污处理成效，为减少弯曲杆菌食源性传播提供技术支持。尽管对低浓度污染（<800 CFU / 拭子）的检测灵敏度有限，但已满足欧盟推荐的加工卫生标准（1000 CFU/g 皮肤）监测需求，具备规模化应用潜力。

论文链接：10.3389/fmicb.2018.02401