“亮点”试纸条：聚集诱导发光纳米探针实现饮用水铜绿假单胞菌15分钟检测

铜绿假单胞菌（PAE）作为典型的革兰阴性机会致病菌，常见于自来水、瓶装水及供水管网等饮用水系统，且能够在低营养条件下存活并形成生物膜，从而成为水系统中持续性污染源；其可引发皮肤、血流及呼吸系统等严重感染，对免疫功能低下人群威胁尤为突出，因此对饮用水中该菌的准确、及时监测对于保障饮水生物安全具有重要意义。传统选择性培养与菌落计数方法虽有效，但检测周期长且依赖专业操作，难以满足现场快速预警需求。侧向层析免疫分析（LFIA）因操作简便、响应迅速，适合用于水质实时监测，但经典金纳米颗粒标记的LFIA在临床及水样检测中的检出限仍偏高，对饮用水中痕量水平的铜绿假单胞菌监测灵敏度不足。为提升灵敏度，研究者发展了荧光纳米材料标记的LFIA，但常规荧光材料在纳米颗粒中高负载时易出现聚集导致淬灭（ACQ），从而削弱信号并限制检测性能。聚集诱导发光（AIE）分子通过在聚集态限制分子内转动与振动，可从机制上克服ACQ，具备高亮度、高量子效率及较大Stokes位移等优势；然而现有AIE纳米球的制备往往工艺复杂且涉及毒性较高的非极性有机溶剂，生物相容性受限，且后续表面功能化常依赖化学偶联，可能降低抗体活性并影响抗原结合能力。因此，构建同时具备超高荧光亮度、良好生物相容性，并实现温和高效抗体标记的新型AIE荧光标记物，成为推动高灵敏LFIA用于饮用水病原菌现场监测的关键与必要方向。

基于此背景，本研究提出以金属多酚网络（MPN）提升生物相容性与界面亲和力，并与AIE发光内核进行自组装，从而构建兼具“高亮度、强相容、免偶联试剂温和标记”的AIENDs，并以此搭建高灵敏LFIA平台。

一、工作原理

（1）将聚集诱导发光纳米点（AIENDs）作为荧光信号载体，其由AIE发光内核与金属多酚网络外壳组成，兼具高亮度荧光输出与良好水分散性。

（2）利用外壳表面的多酚基团与抗体之间的非共价相互作用，将针对PAE的单克隆抗体温和固定于AIENDs表面，形成免疫荧光探针AIEND@mAbs，实现无需偶联试剂的温和固定。

（3）检测时，将AIEND@mAbs与样品预混并孵育数分钟后上样，在毛细作用驱动下沿试纸条迁移；当PAE浓度高于检出限时，AIEND@mAbs@PAE复合物在检测线（T线）被捕获抗体截留形成夹心复合物，紫外激发下呈现可见橙色荧光；无论是否含目标菌，复合物或探针均在质控线（C线）与二抗结合产生荧光信号以确认检测有效，若C线无信号则判定为无效条。免疫动力学分析表明该体系最佳读数时间为上样后15 min，故实际检测以15 min作为判读时间。

图1  AIENDs-LFIA示意图。

二、加标样本检测性能

在上样后15 min读数条件下，在PBS体系中，T线荧光信号与菌浓度呈良好相关关系，建立了稳定的标准曲线，检出限达到974 CFU/mL，线性范围为1×10³至5×10⁴ CFU/mL。与荧光微球标记（CFMs-LFIA）和金纳米标记（AuNPs-LFIA）相比，AIENDs-LFIA的灵敏度分别提高约2.2倍与5.7倍，从而验证AIENDs作为信号标签能够显著提升LFIA的痕量检测能力。此外，特异性实验显示仅目标菌株产生显著荧光响应，其余多种常见致病菌交叉反应极弱，说明该方法具备较高的检测特异性与应用可靠性。

图2  AIENDs-LFIA、CFMs-LFIA与AuNPs-LFIA用于PAE的定量检测。(A) PAE LFIA检测流程示意图，插图为试纸条原型照片。(B) 基于AIENDs-LFIA的PAE定量检测结果。(C) 基于CFMs-LFIA的PAE定量检测结果。(D) 基于AuNPs-LFIA的PAE定量检测结果。(E) AIENDs-LFIA的特异性评估：比较目标菌与其他干扰菌的信号强度，插图为试纸条原型照片。

三、真实水样加标检测

在自来水、矿泉水与纯净水中进行加标回收实验后，AIENDs-LFIA的回收率为82.10%–122.98%，变异系数（CV）均小于7.83%，表明该方法在不同水样基质下具有可接受的准确性与精密度。同时，将AIENDs-LFIA的检测结果与平板计数法进行对比，相关性分析得到R²=0.9914（图3），说明该方法与参考标准方法具有高度一致性，可用于真实饮用水样品中铜绿假单胞菌的快速筛查与定量监测。

图3  基于AIENDs-LFIA的实际样品中PAE分析检测。(A) 基于AIENDs-LFIA检测铜绿假单胞菌的流程示意图。(B) 在自来水、矿泉水、纯净水中的加标回收实验，用于评价方法在真实基质中的定量准确性。(C) AIENDs-LFIA与平板计数法在上述水样中的结果相关性分析（n=3），用于验证方法与参考方法的一致性。全部数据由便携式荧光试纸条读数仪采集。

四、总结

综上，本研究以AIENDs作为高亮度信号标签构建荧光LFIA，在保证检测速度的同时提升了对饮用水中PAE的定量检测能力，并以真实水样回收率、精密度及与平板计数法的一致性作为应用证据。需要指出的是，该方法仍难区分活/死菌，同时不同水样基质仍会导致检出性能存在差异，提示其在复杂基质中的稳健性仍需进一步提升。未来工作可在保持AIENDs标记优势的前提下，重点发展更广谱的识别策略并建立活菌特异识别方法，同时通过样品富集或前处理降低基质效应，并推动多重检测与便携读数一体化，从而增强其在实际饮用水系统中的现场筛查与预警能力。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.microc.2025.116590

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