革命性纳米酶：精准捕获并检测食品中的致命细菌

食品中病原菌污染是全球公共卫生的重大挑战，每年导致数亿人患病和数十万人死亡。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为一种常见的革兰氏阳性病原体，不仅引发胃肠道疾病，还可在不利条件下进入“可存活但不可培养”（VBNC）状态，逃避常规检测并保留致病性，对食品供应链构成持续威胁。现有检测技术如抗体或适配体基方法虽有效，但受限于特异性识别元件的稀缺和抗生素耐药性问题。分子印迹聚合物（MIP）作为人工受体，具有高亲和力和选择性，但其在细菌识别中的应用仍面临模板易变形和印迹层厚度控制等挑战。本研究通过表面组分印迹技术，利用活细菌衍生的片段作为模板，设计了一种核心-壳结构的MIP@磁性纳米酶，旨在实现病原菌的特异性去除和快速检测，为食品污染早期预警提供新工具。该研究聚焦于解决液态食品（如牛奶）中低丰度细菌的持续污染问题，结合磁性分离和酶模拟催化活性，突破传统方法的局限。

1. 纳米酶的设计与合成策略

本研究创新性地采用分步合成法构建了MIP@B-CoFeO纳米酶(如Figure 1所示)。首先，通过水热法合成了羧基化CoFe氧化物（C-CoFeO）纳米酶作为核心，其具有优异的过氧化物酶样活性，可催化鲁米诺/H₂O₂和TMB/H₂O₂体系产生化学发光或显色反应。随后，利用EDC/NHS反应将3-氨基苯硼酸（3-APBA）修饰到C-CoFeO表面，形成pH响应型B-CoFeO纳米酶，其苯硼酸基团可在碱性条件下与细菌表面的顺式二醇组分共价结合。最后，以金黄色葡萄球菌片段为模板，通过多巴胺自聚形成印迹层，去除模板后得到MIP@B-CoFeO纳米酶。这种设计不仅实现了细菌的特异性捕获，还保留了纳米酶的磁性和催化功能。

Figure 1  (a) pH响应性氧化物（B-CoFeO）纳米酶的合成方案，以及(b) 靶向金黄色葡萄球菌的MIP@B-CoFeO纳米酶的合成方案。

2. 纳米酶的物理化学表征与催化活性

表征结果显示，C-CoFeO纳米酶在Fe/Co质量比为3:1时具有最优性能(如Figure 2所示)：平均粒径为163.5 nm，饱和磁化强度为42.8 emu/g，便于磁性分离。XPS分析证实其表面富含羧基，且Co²⁺/Co³⁺和Fe²⁺/Fe³⁺比值相近（分别为0.603和0.670），确保了高效的类芬顿催化反应。在催化性能测试中，C-CoFeO对鲁米诺/H₂O₂体系（化学发光）和TMB/H₂O₂体系（显色反应）均表现出强活性，其中Co元素主导鲁米诺催化，而Fe元素主导TMB催化。优化后的B-CoFeO纳米酶通过苯硼酸基团实现了对腺苷的特异性识别，验证了其pH响应特性。

Figure 2  C-CoFeO纳米酶的类过氧化物酶活性：(a)鲁米诺/H2O2体系的催化反应，(b)TMB/H2O2体系的催化反应。(c)不同FeCl3·6H2O质量下C-CoFeO纳米酶的粒径分布与平均粒径。(d)C-CoFeO纳米酶的磁滞回线。(e)C-CoFeO纳米酶的XRD图谱。(f)C 1s、(g)O 1s、(h)Co 2p和(i)Fe 2p的XPS元素高分辨谱图。

3. 特异性识别能力与细菌捕获效率

MIP@B-CoFeO纳米酶展现出卓越的特异性。XPS和TEM分析证实了印迹层的成功形成（B元素含量0.04%，N元素0.22%）。通过CFU计数法评估，其印迹因子高达4.72，优于全细菌印迹版本（IF=2.14）(如Figure 3所示)。在混合菌液实验中，MIP@B-CoFeO对金黄色葡萄球菌的捕获效率达91.32%，而对大肠杆菌（E. coli）或其他革兰氏阳性菌（如溶血葡萄球菌和乳房链球菌）的捕获率均低于35%，凸显了其高选择性。荧光显微镜和SEM图像直观显示了纳米酶在细菌周围的聚集现象，进一步验证了特异性结合。

Figure 3  (a) 采用CFU计数法测定MIP@B-CoFeO纳米酶从含有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混合溶液中对金黄色葡萄球菌的特异性识别能力。(b) 金黄色葡萄球菌溶液、(c) 大肠杆菌溶液及(d) 金黄色葡萄球菌与大肠杆菌混合溶液中MIP@B-CoFeO纳米酶特异性识别金黄色葡萄球菌的SEM图像。(e) 含金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌、(f) 含金黄色葡萄球菌和乳房链球菌的混合菌液中MIP@B-CoFeO纳米酶对金黄色葡萄球菌的特异性识别。(g) 采用CFU计数法评估NIP@B-CoFeO、WMIP@B-CoFeO和MIP@B-CoFeO纳米酶对金黄色葡萄球菌的识别能力。

4. 检测性能与实际应用验证

MIP@B-CoFeO纳米酶实现了无标记定量检测。优化参数后（H₂O₂浓度100 mM，TMB浓度800 μM），细菌浓度与催化信号呈负线性关系(如Figure 4所示)：化学发光检测限低至7.76 CFU/mL（R²>0.98），比色法检测限为12.59 CFU/mL。在牛奶样本中，检测性能稳定（LOD=13.13 CFU/mL），回收率达89.64%-109.90%。纳米酶可重复使用5次，捕获能力仅下降5.73%，且在pH 5-9范围内均有效。荧光显微镜证实其能同时捕获活、死和VBNC状态细菌，突破了传统检测局限。

Figure 4 MIP@B-CoFeO纳米酶催化TMB/H₂O₂体系的检测参数优化：(a) H₂O₂浓度和(b) TMB浓度。MIP@B-CoFeO纳米酶催化鲁米诺/H₂O₂体系的检测参数优化：(c) H₂O₂浓度和(d) 鲁米诺浓度。(e) 金黄色葡萄球菌浓度与MIP@B-CoFeO纳米酶催化化学发光强度的相关性。(f) 金黄色葡萄球菌浓度与MIP@B-CoFeO纳米酶在652nm处吸光度的相关性。(g) MIP@B-CoFeO纳米酶的再生与重复使用性能。(h) pH值对MIP@B-CoFeO纳米酶特异性识别金黄色葡萄球菌的影响。使用荧光显微镜测定MIP@B-CoFeO纳米酶对死活金黄色葡萄球菌的识别能力：(i) SYTO9和碘化丙啶染色的金黄色葡萄球菌溶液，(j) 加入MIP@B-CoFeO纳米酶反应30分钟。(k) MIP@B-CoFeO纳米酶对牛奶中金黄色葡萄球菌的检测性能。

本研究成功开发了一种创新的MIP@磁性纳米酶平台，通过整合分子印迹技术、磁性分离和酶模拟催化，实现了对金黄色葡萄球菌的高效去除和灵敏检测。其核心优势在于利用细菌表面片段作为印迹模板，克服了全细菌模板的变形问题，确保了特异性识别活、死及VBNC状态细菌。纳米酶的磁性特性支持快速分离，催化活性则无需标记即可定量，检测时间短至5-15分钟，灵敏度优于现有方法（如免疫磁珠或噬菌体基技术）。实际应用表明，该平台在复杂基质（如牛奶）中表现稳健，为食品工业提供了早期污染预警工具。然而，纳米酶在重复使用中因印迹层磨损导致效率轻微下降，且pH操作范围受苯硼酸基团pKa限制，未来可通过优化功能单体扩展适用性。总体而言，该策略为病原菌控制提供了多功能解决方案，不仅适用于食品安全，还可拓展至环境监测和医疗诊断领域，具有重要的科学和实用价值。

原文链接: https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.173240