1. 引言

霉菌毒素是真菌产生的有毒分子，化学和热稳定性强，在作物种植、储存、运输及食品加工中难以去除，可通过饮食多种途径暴露，引发慢性毒性，世卫组织、欧盟等机构对其设定极低限量标准。

传统色谱法虽常用，但依赖昂贵仪器和专业人员，检测成本高、耗时久，无法满足现场快速检测需求。

侧向流分析法（LFA）具备快速、低成本、操作简便、便携等优势，符合世卫组织 ASSURED 标准，成为霉菌毒素快速检测的理想选择。近十年相关研究成果丰富，亟需围绕其检测格式、识别元件、试纸条设计等核心技术进行系统梳理与分析。

本研究构建了集成抗体、适体（Aptamer）、纳米抗体（Nanobody）三类识别元件的侧向流分析法（LFA）检测体系，通过竞争性免疫分析格式实现霉菌毒素检测。抗体为传统主流识别元件，适体通过 SELEX 技术筛选获得，纳米抗体源自骆驼科动物重链抗体片段，三者均借助疏水作用、氢键等弱吸引力与霉菌毒素特异性结合；LFA 试纸条经酸诱导优化检测线 / 控制线试剂固定效率，通过标记物与识别元件的溶剂交换式偶联实现信号稳定输出。金纳米颗粒（AuNPs）、量子点（QDs）等标记物通过界面电荷转移赋予体系高灵敏度，试纸条依赖氢键、离子键和共价键协同作用，提升机械稳定性与检测特异性。该方法可在常温及复杂基质条件下，通过荧光强度或比色信号变化实时监测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A 等强效霉菌毒素，结合多检测线设计或多标记策略实现多重检测，且检测结果与色谱法验证结果高度一致，为食品中霉菌毒素污染的快速筛查提供精准技术支撑。

2. 结果与讨论

竞争性侧流层析法检测霉菌毒素：霉菌毒素为低分子量化合物，该方法是其主流检测格式。试纸条含样品垫、结合垫等组件，检测线固定半抗原，控制线固定二抗，标记抗体与样品中霉菌毒素竞争结合，信号随毒素浓度升高而减弱，可检测黄曲霉毒素等强效霉菌毒素。

图 1. 近十年 147 篇论文的数据；a) 霉菌毒素侧流层析检测的靶点，b) 霉菌毒素 LFAs中使用的识别元件，c) 霉菌毒素 LFA 中使用的标签（时间分辨荧光微球 TRFM、上转换纳米颗粒 UCNP、磁性纳米颗粒 MNP、表面增强拉曼光谱 SERS）。

图 2. 基于抗体的竞争性侧流检测，包含背卡、硝酸纤维素膜、样品垫、标记抗体结合垫、测试线上的固定化目标、控制线上的二抗和吸水垫。

识别元件：含抗体、适体、纳米抗体三类。抗体应用最广但批间差异大、稳定性差；适体为合成核酸，批间重复性好、稳定性高，但筛选耗时；纳米抗体为单域片段，分子量小、亲和力强，可微生物重组表达，三者均通过弱吸引力与霉菌毒素特异性结合。

图 3. 识别元件的示意图，a) 抗体具有两条轻链（L）、两条重链（H）、可变区（V）对应于互补决定区（CDR）、抗原结合片段（Fab）和结晶片段（Fc）；（b）纳米抗体是重链抗体（HCAb）的 VHH 片段；（c）样品适配体结构。

图 4. a) 检测霉菌毒素的侧流层析试纸条测试线成分（牛血清白蛋白 BSA、卵清蛋白 OVA、脱氧核糖核酸 DNA），b) 对照线成分。

基于抗体的新检测格式：在传统竞争格式基础上创新，包括未标记一抗与标记二抗组合、生物合成抗原偶联物替代半抗原 - BSA、检测线固定抗独特型纳米抗体等设计，还开发了通用检测格式与颜色 hue 识别模式，显著提升检测灵敏度与适用性。

图 5. 基于抗体的侧流层析试纸条组件示例，包括不同标记的识别元件（红色圆圈），包括直接与标记结合的抗体（a）、通过蛋白 G 结合的抗体（b）、二抗（c）或通过生物素-链霉亲和素相互作用标记的纳米抗体（d）。在检测线（绿色圆圈）上，目标-BSA/OVA（e）、纳米抗体（f）或生物合成抗原（g）被固定，标记的单克隆抗体或纳米抗体与之结合。在控制线（蓝色圆圈）上，二抗（h）或蛋白 A（i）被固定，捕获标记的单克隆抗体。或者，BSA-生物素（j）捕获标记的链霉亲和素（虚线圆圈）。创建于 https://BioRender.com。（对于本图例中颜色引用的解释，读者请参阅本文的网页版本。）

图 6. 通用侧流层析试纸条设置，测试线上有抗 BSA，控制线上有二抗；a) 存在目标时，b) 不存在目标时，样品与目标特异性抗体和目标-BSA 偶联物孵育。观察到信号随目标浓度增加而减弱[99]。

基于适配体的新型检测方法：以适配体替代抗体作为识别元件，可通过互补 DNA 竞争、链杂交调控、吸附 - 解吸等模式设计试纸条，结合磁分离、纳米酶催化等技术增强信号，检测限低，且能与抗体组合使用，拓展了检测设计思路。

图 7. 基于适配体的侧流层析法示例，测试线上有标记适配体-多聚 A，控制线上有互补 DNA 和多聚 T。

图 8. 基于适配体的竞争性侧流层析法示例，其中样品与生物素-适配体和互补的氰基 5（Cy5）修饰 DNA 预孵育；a) 在存在靶标时，当生物素-适配体与测试线上的链霉亲和素结合时，测试线上无信号出现。对照线始终显示信号，因为抗-Cy5 捕获 Cy5；b) 在不存在靶标时，生物素-适配体和 Cy5-DNA 杂交；当该复合物与测试线结合时，出现信号。

图 9. 基于适配体的侧流层析法示例，采用吸附-解吸方法；a) 在存在目标物时，适配体捕获目标物并从金纳米粒子表面解吸。当生物素化适配体与测试线上的链霉亲和素结合时，无信号出现。b) 在不存在目标物时，适配体吸附到金纳米粒子表面。当吸附在 AuNP 上的生物素化适配体被测试线上的链霉亲和素捕获时，出现信号。控制线上的带电聚合物确保 AuNPs 被捕获，并出现信号。

基于抗体的“开启式”侧流层析法：基于半抗原与目标物竞争结合原理，通过荧光团与猝灭剂（如 AuNPs 与 QDs）的 FRET 机制实现信号 “开启”，目标物浓度越高，荧光信号越强，解读更直观，部分可实现多重检测，提升了检测便捷性。

图 10. 以 AuNP 为猝灭剂和检测线荧光体的“开启型”侧流层析法；a) 在存在目标物时，抗体不能结合到检测线，荧光体发光；b) 在不存在目标物时，抗体-AuNP 结合到检测线，荧光被猝灭。

图 11. 在检测线上有正交发光上转换纳米颗粒的单线“开启”侧流层析法；a) 在存在目标时，抗体不能结合到检测线，上转换纳米颗粒在 980 nm 照射下发出红光，在 808 nm 照射下发出绿光；b) 在不存在目标时，抗体-金纳米颗粒结合到检测线，绿光被猝灭，而红光发射保持。

基于适配体的“开启式”侧流层析法：借助适配体链切换特性，通过目标诱导链释放、纳米结构拆解等机制激活信号，可设计多通道检测模式，结合催化发夹组装、分支杂交链式反应等技术，进一步降低检测限，但部分方法孵育时间较长。

图 12. 基于适配体的“开启式”侧流层析法，目标诱导链释放，a)测试条组件，b)在目标不存在时，c)在目标存在时。

图 13. 基于适配体的“开启式”侧流层析法，带有连接捕获序列，a) 测试条组件，b) 无目标存在时，c) 有目标存在时。

图 14. 链接翻转组装的纳米亲和传感器; a) 在存在目标物时，标记的生物素化亲和体与目标物结合，复合物沿条带移动并被测试线上的链霉亲和素捕获，产生信号；b) 在不存在目标物时，不同标签上的亲和体通过连接 DNA 形成聚集体，阻止沿膜移动，不出现信号。

图 15. 基于开关型适配体的侧向层析分析中的催化发夹组装。

多重检测：通过多试纸条共享样品垫、单条多检测线、单检测线多标记、微阵列等设计，可同时检测多种霉菌毒素。需避免反应干扰，部分方案能减少材料消耗与样品体积，适配实际样品中多毒素污染的筛查需求。

图 16. a) 近十年用于检测霉菌毒素的侧流层析分析（LFA）研究中使用的检测方法；b) 过去十年中用于单联霉菌毒素 LFA 的检测限（LOD）。

图 17. 过去十年霉菌毒素侧流层析法的检测限

3. 总结

LFA 是霉菌毒素检测的重要工具，在食品安全管控中发挥关键作用，其核心优势在于快速、低成本、操作简便，但仍有较大优化空间。

适体替代抗体可降低生产成本、提升批间一致性和稳定性，且无动物源性，是 LFA 的重要发展方向，但需解决 SELEX 筛选耗时、孵育时间过长等问题，优先开发室温操作方案。金纳米颗粒仍是最常用的标记物，但量子点、磁性纳米颗粒、纳米酶等新型标记物可提供更强信号和多模式检测，结合智能手机等便携设备，能实现低成本、高灵敏度读取。

“Turn-on” 型 LFA 和多重检测 LFA 能提升结果解读直观性和检测效率，是未来重点发展方向，其中多重检测需在减少材料消耗和样品体积的同时，避免反应干扰和交叉反应。

未来需推动 LFA 检测技术的商业化转化，重点验证其在不同温湿度环境下的稳定性，针对多种基质进行优化，通过分析物富集、信号增强等策略进一步降低检测限，同时完善标准化流程，确保检测结果的可靠性和可比性。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.trac.2025.118273