抗菌药物耐药性已成为全球公共卫生的重要威胁，不当用药促使多重耐药菌持续增加，给重症感染救治带来显著压力。临床药敏检测（AST）仍以培养为基础，通常需要24–96小时，难以满足脓毒症等急危重症对“快速用药决策”的需求。尽管PCR、测序和质谱等方法可缩短检测时间，但多依赖耐药基因信息，难以直接反映耐药机制的功能状态，且成本与操作门槛较高。鉴于β-内酰胺酶是多类耐药菌常见的功能性标志，若能在单细胞水平实时读取其酶活变化，即可在无需培养的情况下快速判断细菌存活与药物抑制效果，从而实现更及时、可转化的功能性药敏评估。因此，开发一种高灵敏、流程简化且适用于临床样本的快速检测策略具有重要必要性。基于此背景，本研究尝试构建基于刺激响应型共振拉曼散射成像（SRRRS）的单细胞耐药检测方法，以突破传统检测模式的时间瓶颈，为抗菌治疗提供更加及时和可靠的决策依据。其核心原理如图1所示：通过利用β-内酰胺酶可特异性水解底物nitrocefin的特性，将酶促反应与光谱信号增强相耦合。当β-内酰胺环被切开后，分子构型发生显著改变，电子由cephem环向硝基苯基团迁移，导致共轭体系增强，吸收峰由386 nm红移至480 nm。这种电子结构重排使水解产物与633 nm激光形成共振条件，从而触发显著的共振拉曼增强效应。与未水解底物相比，其特征拉曼峰强度提升2–3个数量级，实现了“无信号—强信号”的清晰转变。

图1  β-内酰胺酶触发的刺激响应型共振拉曼增强机制示意。

一、方法构建及其性能

本研究方案适用于多种临床常见β-内酰胺酶亚型的检测，在633 nm激发下均可产生稳定且显著增强的特征拉曼信号；酶浓度与拉曼强度之间存在明显的线性关系，可实现pg·mL⁻¹级酶检测与10² cfu·mL⁻¹级细菌检测。此外，通过加入特异性抑制剂进行对照实验，证实信号增强直接来源于β-内酰胺酶活性，而非非特异性背景干扰（图2）。进一步，如图3所示，作者将该体系拓展至单细胞成像层面，实现对细菌耐药表型的直接功能性判别。产酶耐药菌在单细胞尺度上呈现出显著增强的特征拉曼峰，而不产酶的敏感菌则维持接近背景水平的弱信号，形成清晰的信号对比。该方法无需扩增培养或基因检测，即可通过检测酶活性实现对活菌耐药功能的快速识别，从而在数小时内完成传统方法需数十小时才能获得的判断。

图2  刺激响应型共振拉曼体系的广谱性、特异性与高灵敏检测性能验证。

图3  单细胞水平的共振拉曼成像实现耐药菌的快速功能性识别。

二、应用验证

首先，如图4所示，作者以临床高发且耐药问题突出的铜绿假单胞菌（PAK）为对象，构建了基于SRRRS成像信号的药敏判读框架。通过对20株PAK开展对比实验，确定了环丙沙星与妥布霉素的SRRRS成像breakpoint，并将其定义为“使单细胞特征拉曼信号出现明确衰减的最低药物浓度”，从而把成像读出转化为可操作的药敏阈值。随后，作者建立小鼠背部感染模型，对不同临床分离株进行感染与采样，在SRRRS成像AST判读基础上选择相应抗生素方案，并以组织细菌负荷与感染表型作为结局指标进行验证。结果显示，不同菌株对两种药物的敏感或耐药差异与体内感染结局高度一致，表明该方法不仅能够输出“是否耐药”的信息，还能够形成“选药依据”，具备指导治疗决策的可行性。进一步地，如图5所示，为实现临床场景的标准化与规模化应用，作者依据CLSI推荐药物体系扩展并建立了PAK针对14种抗生素的SRRRS成像breakpoint库，覆盖β-内酰胺类与非β-内酰胺类药物。基于该库，研究对30例ICU患者体液样本开展快速药敏检测（包括痰液、支气管肺泡灌洗液、尿液、脓液及鼻窦冲洗液等），并与传统MIC结果进行一致性对照。总体结果显示，SRRRS成像AST可在不依赖细菌培养的前提下于3小时内完成判读，整体准确率达到93%，显著缩短了传统培养药敏通常需要48至96小时的周转时间。少数不一致样本主要与细菌载量偏低有关，提示该方法在临床应用中需对最低有效细胞数或采样富集步骤进行规范化。

图4  SRRRS成像药敏阈值的建立及其在小鼠感染模型中的用药验证。

图5  面向临床样本的SRRRS成像药敏检测：PAK断点库构建与ICU患者验证。

综上，本研究提出并验证了一种刺激响应型共振拉曼散射成像（SRRRS）的单细胞药敏检测新范式，其创新性在于将β-内酰胺酶对nitrocefin的特异性水解反应转化为可被633 nm激发的强共振拉曼信号，实现了由“酶促触发”到“光谱放大”的直接信号链路，从而在无需细菌培养的条件下，以单细胞分辨率完成对耐药表型与药物抑制效应的功能性判读，并进一步通过构建针对铜绿假单胞菌的多抗生素断点库与ICU临床样本验证，展示了将快速检测结果直接服务于用药决策的转化潜力。需要指出的是，该策略对检测对象的适用范围在现阶段仍与β-内酰胺酶相关的生物学背景密切耦合，部分病原体或耐药机制若不表达或低表达β-内酰胺酶，可能影响方法普适性；同时，单细胞成像判读对样本中可观测细菌数量、固定与富集步骤以及成像平台条件具有一定依赖，低菌载量样本可能带来判读偏差，且拉曼成像设备与操作流程在临床常规化部署上仍存在成本与标准化挑战。

原文DOI: 10.1002/anie.202509898