细菌感染仍是全球公共卫生的重要威胁，更关键的是由于经验性用药或诊断延迟，抗生素耐药持续攀升，使得早期、精准的病原学判断成为合理用药的前提。当前PCR等核酸检测虽灵敏，但易出现假阳性且往往需要严格的样本预处理；MALDI-TOF MS虽快速且无需标记，却在近缘菌株蛋白谱重叠时分辨率不足。这些局限共同指向一个长期存在的临床空白：在复杂基质中实现快速、菌株水平且稳健的识别。受嗅觉启发的传感器阵列（化学鼻/化学舌）结合模式识别可在短时间内区分细菌，荧光阵列还具备灵敏、读出便捷等优势，但其临床转化仍受两大瓶颈制约：信号多源于与细菌表面的非特异相互作用，易被尿液等复杂基质干扰，生化解释性不足；同时多数阵列检测群体信号，输出随细胞浓度变化而漂移，导致不同浓度样本难以获得一致指纹。尤其在临床样本中，病原体种类与丰度往往同时未知，既要盲检又要保证跨批次可重复性，这对传统阵列提出更高要求。基于此，本研究提出在单细胞尺度采集指纹并以正交生化探针表征细菌内在特征的策略，从机制上提升可解释性并削弱浓度不确定性带来的误判，为临床快速、可靠诊断提供必要的新路径。因此，构建一种对浓度鲁棒、对基质抗干扰、且便于建库扩展的识别体系具有迫切必要性。

        基于此，本研究提出一种“浓度无关细菌识别”（CIBI）的单细胞指纹策略，其总体思路如图1所示：首先以三类正交生化探针模块同时标记细菌，分别从细胞壁合成、表面多糖以及细胞壁重塑等不同生理维度获取信息，形成多通道荧光指纹；随后采用流式细胞术对单细胞事件进行逐个读取，并以大量细胞事件的统计特征构建样本指纹，从而在机制层面削弱传统群体检测对细菌浓度波动的敏感性。在此基础上，研究进一步建立参考数据库，将不同菌株的指纹特征进行标准化存储，并引入监督学习模型对未知样本进行分类预测，实现从“指纹采集”到“模型判别”的闭环流程。相较于依赖非特异吸附的传统传感器阵列，该策略将识别依据从表面相互作用提升为可追溯的生化过程差异，同时通过单细胞层面的统计汇总降低样本浓度不确定性带来的误差，为复杂基质中的快速细菌鉴定提供了更稳健、更可解释的技术路径。

图1  传统传感器阵列与CIBI单细胞指纹阵列的对比示意。

首先，如图2所示，作者展示了CIBI指纹的形成过程与初步区分能力。以10⁵ CFU/mL的EF与EC为例，在500 μM DADA-FITC、500 μM DA-Tz、10 μM PBA-Cy3条件下37°C孵育60 min，随后加入10 μM TCO-Cy5反应10 min完成三通道读出，EF在SM1与SM3上整体强于EC。进一步扩展到9株模型菌，可获得可重复且可区分的荧光指纹，并呈现G+在SM1/SM3偏强的总体趋势，为后续建库与分类提供依据。进一步地，图3针对临床样本“浓度未知”的关键难点进行验证：作者构建多浓度数据集（OD600 = 0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005），结果显示同一菌株跨浓度的指纹保持一致，HCA按菌株而非浓度聚类，且LDA在测试集上实现100%分类准确率，证明该指纹具有浓度无关性。同时，作者还在CCA相关分析中报告总体准确率为88.9%，错分主要发生在EF与VRE（约20%）以及Sa与SE（约13%）之间，但仍保持物种水平正确。最后，作者将体系推进至复杂基质应用（图4），在尿液单菌加标样本中，LDA总体准确率达95.2%，进一步用随机森林提升至97.6%，错分主要发生在近缘株（如Sa与SE）之间但属水平仍保持正确，体现方法对基质干扰的鲁棒性与临床应用潜力。

图2  CIBI传感器阵列策略及其荧光指纹表征（以多模块标记实现细菌指纹化）。

（A）比较EF与EC经三种模块处理后的荧光信号变化：SM1（DADA-FITC，胞内代谢标记）、SM2（PBA-Cy3，共价作用/糖链识别）、SM3（DA-Tz掺入后与 TCO-Cy5 click 输出信号。（B）CIBI阵列策略流程图。（C）9种细菌模型菌株的荧光指纹，用于说明该阵列能产生可区分的多维信号模式。

图3  CIBI传感器阵列的浓度无关性验证。（A）对比传统浓度依赖型阵列与本文CIBI阵列在浓度变化下的响应差异。（B）细菌指纹识别的热图展示。（C）基于指纹相似性进行层次聚类的树状图。（D）指纹在LDA判别空间的分布，用于评估跨浓度样本的可分性。（E）菌株水平的指纹分类准确率统计；图中椭圆为95%置信区间。

图4  病原体加标尿液样本的识别。（A）基于参考数据库，对尿液加标样本进行层次聚类，用于判断其与已知类别的相似性归属。（B）将加标样本投影到参考数据库训练得到的LDA判别空间，实现分类识别。（C）同时展示参考数据库（i）与尿液加标样本（ii）的指纹热图及对应预测结果。（D）RF对参考数据库与加标样本的分类表现，体现集成模型的判别能力。

综上，本研究提出CIBI策略，以三类正交生化探针从细胞壁合成、表面多糖与细胞壁重塑等机制维度获取信息，并借助流式细胞术在单细胞层面进行统计读出构建指纹，从而在方法学上同时提升了细菌识别的可解释性与对浓度波动的鲁棒性，为复杂基质中的快速病原鉴定提供了新的技术路径。但该工作仍存在关键局限：研究主要验证的是单菌培养物及尿液单菌加标样本，尚未展示或系统评估混合感染（多菌共存）样本的检测与解析能力，因此对真实临床多菌样本的适用性目前仍无法直接证明；同时流程依赖流式平台与多步标记反应，数据库规模有限，也可能限制其在更大谱系、多状态样本中的泛化。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c05097