1.引言

Argonaute（Ago）蛋白广泛存在于各类生物中，原核生物 Ago（pAgos）凭借可编程核酸切割活性，在核酸检测领域展现出超越 CRISPR/Cas 系统的优势，如多重检测能力强、无需 PAM 序列、DNA 向导更稳定经济等。然而，现有 pAgos 检测系统均依赖外源向导链，需精心设计向导和报告序列，限制了其广泛应用。此外，部分 pAgos 还具有向导非依赖的核酸酶活性（即 "chopping" 活性），可在无外源向导时将核酸降解为小片段，但该活性的生化机制与实际应用尚未被充分探索。呼吸道感染中，百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌和肺炎支原体等病原体临床症状重叠，传统检测方法存在周转时间长、灵敏度不足或操作复杂等问题，亟需开发简便高效的多重检测技术。

本研究系统表征了 Thermus brockianus Argonaute（TbAgo）的向导非依赖核酸酶活性，发现其在 69℃以上温度、碱性低离子强度条件下，可在 Mg²⁺或 Mn²⁺参与下高效降解双链 DNA，且对低 GC 含量底物具有偏好性。该活性依赖保守的 DEDX 催化基序，MID 结构域在底物结合中发挥关键作用。基于此，研究开发了 chop-NAD 检测平台，将 TbAgo 的 chopping 活性与 LAMP 扩增技术整合：LAMP 在 65℃下 15 分钟完成靶标扩增，随后升温至 72℃触发 TbAgo 介导的扩增子与特异性双标记报告探针降解，释放荧光信号。通过石蜡封装技术构建单管检测系统，实现 "样本加载 - 扩增 - 检测" 的一体化流程，避免交叉污染。该平台成功实现对三种呼吸道病原体的多重检测，检出限分别为百日咳鲍特菌 2.38 基因组当量 /μL、副百日咳鲍特菌 2.04 基因组当量 /μL、肺炎支原体 59.7 拷贝 /μL，且能有效区分单核苷酸错配，对常见呼吸道病原体无交叉反应。

2.结果与讨论

TbAgo表现出非典型核酸酶活性：TbAgo 在无外源向导链时，于≥69℃、碱性低离子强度及 Mg²⁺/Mn²⁺存在下，展现出向导非依赖的核酸酶（chopping）活性。该活性可降解双链 DNA 及互补单链形成的杂合链，产物为短片段，偏好低 GC 含量底物，且依赖保守 DEDX 催化基序，属于非典型核酸酶功能。

图1。TbAgo DNase活性的生化表征。（a） 在含有10 mMTris-HCl和10 mM MgCl₂（pH7.5）的反应缓冲液中，TbAgo介导的5′-FAM标记ssDNA（FAM-DNA）降解，环境为5′-OH互补SSDA，温度为73.5°C;（b）在有无互补SSD时的反应;（c–g）不同缓冲条件对切割活性的影响：（c） pH，（d） NaCl 浓度，（e） 二价阳离子，（f） Mn²⁺浓度，以及（g）Mg²⁺专注;（h） GC含量变化的dsDNA底物上的切割效率。所有反应均包括500 nM TbAgo、500 nM FAM-DNA和500 nM 互补SSDNA（a–g）或500 nM dsDNA底物（h）。产物通过14%变性PAGE（图h用SYBR金染色）分辨，并使用便携式荧光成像系统（Bluepad）进行可视化。

TbAgo介导DNA底物切割的突变分析：通过对 TbAgo 的 DEDX 催化基序及 MID 结构域关键残基进行丙氨酸突变分析，证实 D550 是催化核心，对向导依赖切割和 chopping 活性均不可或缺。MID 域突变体或保留部分切割功能，或特异性丧失 chopping 活性，表明 MID 域在底物结合与活性调控中起差异化作用，且 chopping 活性遵循 RNase H 型催化机制。

图2。Tbago介导DNA切割的突变分析。（a）纯化选定的丙氨酸替代突变体;（b，c）在野生型TbAgo或TbAgo突变体存在下，FAMDNA由19-nt 5′-P导导引导的导引性切割;（d，e）在FAM染色体DNA上对野生型TbAgo和TbAgo突变体在36-nt 5′-OH互补SSD存在下，导导无关性“切割”活性;（f） 野生型TbAgo对具有不同5′端修饰的DNA底物进行导导无关切割。所有反应均使用500 nM TbAgo或TbAgo突变体、500 nM FAM-DNA，以及500 nM 19-nt 5′-P导引或500 nM 36-nt 5′-OH互补SSDA进行。产物通过14%变性PAGE（图f中用SYBR金染色）分辨，并用Bluepad进行可视化。通过使用ImageJ软件进行灰度分析量化了切割效率。数据以两个独立复制（n = 2）的平均±标准差（SD）形式呈现，使用GraphPad Prism 8处理。

利用切割活性检测核酸：基于 TbAgo 的 chopping 活性，构建核酸检测体系：靶标核酸与双标记报告探针形成双链后，触发 TbAgo 降解反应，使荧光基团与淬灭剂分离产生信号。该系统对单链 DNA 可区分单核苷酸错配，对双链 DNA 可识别特定三核苷酸错配，最小可检测 15 nt/bp 的靶标，浓度检出限为 50 nM。

图3。开发基于切割的核酸检测平台，采用TbAgo。（a）传统导向和新颖的基于切割的策略示意，用于序列特异性检测ssDNA和dsDNA靶点;（b，c）优化反应温度以检测ssDNA（TS-40）（b）和dsDNA（通过退火TS-40和NTS-40形成）（c）;（d，e）优化双标记报告探针长度以实现ssDNA（d）和dsDNA（e）检测;（f，g）使用22-nt报告器评估ssDNA（f）和dsDNA（g）的可检测靶向长度范围。所有反应均在1× Hzymes反应缓冲液中进行，并补充6 mM MgSO₄，包含500 nM TbAgo、500 nM靶标DNA和500 nM双标记报告蛋白。荧光在qPCR仪器上实时监测。数据以两个独立复制（n = 2）的平均值 ± SD 形式呈现，使用 GraphPad Prism 8 处理。

开发chop-NAD病原体检测法：整合 TbAgo 的 chopping 活性与 LAMP 扩增技术，开发 chop-NAD 检测法。LAMP 在 65℃下 15 分钟扩增病原体靶标，随后 72℃下 TbAgo 特异性降解扩增子与报告探针。该方法对百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌及肺炎支原体的检出限分别低至 2.38 gEq/μL、2.04 gEq/μL 和 59.7 copies/μL。

图4。开发了用于病原体检测的chop-NAD检测法。（a）chop-NAD测定积分LAMP方法的工作流程;（b–d）筛选BP（b）、BPP（c）和MP（d）引物组;（例如）BbAgo检测BP（e）、BPP（f）和MP（g）检测温度的优化;（H–j）对BP（h）、BPP（i）和MP（j）进行LOD判定。LAMP在65°C下按照制造商的方案进行15分钟，随后加入TbAgo反应混合物并在72°C下培养。 最终浓度：1000 nM TbAgo 和 500 nM 报告器。荧光被实时监测。数据以均值标准差±表示;n = 2 表示 （b–g），n = 3 表示 （h–j），使用图形垫棱镜 8 处理。

呼吸道病原体的多重检测：构建三重 chop-NAD 检测体系，通过特异性引物与不同荧光标记的报告探针，实现单管同时检测三种呼吸道病原体。该体系正交性良好，无交叉反应，对常见干扰病原体特异性强，临床样本检测结果与 PCR 完全一致，可快速区分症状重叠的呼吸道感染病因。

图5。利用chop-NAD检测法多重检测呼吸道病原体。（a） 正交性测试显示BP、BPP和MP检测信道间串扰极少;（b）对非靶向病原体进行特异性评估，包括鲍曼不动杆菌（AB）、金黄色葡萄球菌（SA）、肺炎链球菌（SP）、肺炎克雷伯氏菌（KP）、流感嗜血杆菌（HI）、甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）;（c–e）多路复用格式的BP （c）、BPP （d）和MP （e）的敏感性分析;（f） 使用三重切片-NAD系统检测临床样本。三重LAMP在65°C下进行15分钟，随后在72°C进行TbAgo检测。 最终浓度：2000 nM TbAgo，400 nM（血压报告），400 nM（BPP报告），200 nM（MP 报告）。在qPCR仪器上测量了实时荧光。数据以均值标准差±表示;n = 2 表示 （a， b， f），n = 3 表示表示 （c–e），使用图形垫棱镜 8 处理。

一个石蜡封装的单锅平台，用于样品到答案分析：设计石蜡封装的冻干单管检测平台，将 TbAgo 及报告探针封装于石蜡层内，LAMP 试剂预冻干于管底。样品加入后自动复溶扩增，升温至 72℃时石蜡融化释放检测试剂，完成闭环检测。该平台操作简便、防污染，实现 "样本加载 - 检测 - 读数" 的样品到答案分析，适配即时检测场景。

图6。石蜡封装单位检测平台。（a） 石蜡包裹单罐检测平台示意图;（b）可行性测试，证明热激活试剂释放后BP、BPP和MP三重检测成功;（c） 采用冻干、石蜡密封的单罐样品检测。三重LAMP在65°C下进行15分钟，随后温度提升至72°C激活TbAgo。荧光被实时监测。数据以两次独立重复的均值±标准差（n = 2）形式呈现，使用GraphPad Prism 8进行分析。

3.总结

本研究开发了基于 TbAgo 向导非依赖核酸酶活性的 chop-NAD 核酸检测平台，通过整合 LAMP 扩增与石蜡封装技术，实现呼吸道病原体的高灵敏、高特异性多重检测。该平台无需外源向导链，简化了 assay 设计；单管封闭流程降低污染风险，冻干格式便于储存运输。

其优势体现在：检测灵敏度高，可检出痕量病原体；特异性强，能区分单核苷酸差异；多重检测能力突出，可同时识别三种目标病原体；操作简便快速，全程仅需 45 分钟左右，与临床 PCR 结果完全一致。该技术突破了传统 pAgos 检测系统对向导链的依赖，为核酸即时检测提供了新范式，有望广泛应用于传染病诊断、食品安全监测等领域，尤其适用于资源有限的基层场景。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118370