沙门氏菌是全球食源性疾病的主要致病菌之一，已鉴定出超过2610种血清型，其中肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌是最常见的人类感染血清型。传统的免疫分析方法通常依赖单克隆或多克隆抗体，但这类抗体通常只能针对特定抗原表位，识别范围有限，难以实现沙门氏菌的广谱检测。此外，传统抗体结构复杂、分子量大、在苛刻条件下稳定性差，且其与抗原结合的具体机制尚未完全阐明。纳米抗体作为天然缺失轻链的单域重链抗体，具有分子量小、稳定性高、易于改造和表达等优点，是开发广谱识别探针的理想候选。然而，目前针对沙门氏菌广谱血清型检测的纳米抗体及其结合机制研究仍然有限。

为解决这一问题，本研究旨在通过羊驼免疫和交叉抗原筛选策略，从噬菌体展示文库中筛选能够识别多种沙门氏菌血清型的广谱纳米抗体，并深入探究其靶向的抗原蛋白及关键的分子结合机制，为开发新一代沙门氏菌检测与监测工具提供理论依据和试剂基础。

研究内容

图1.纳米抗体的筛选与基本特性

通过用灭活的肠炎和鼠伤寒沙门氏菌免疫羊驼，构建了噬菌体展示纳米抗体文库。采用交叉抗原（交替使用两种血清型细菌）进行四轮生物淘选，成功富集了特异性克隆。从文库中筛选出两个纳米抗体VHH-II-2和VHH-II-3。它们序列高度相似，具有骆驼科纳米抗体的典型特征。两者均表现出优异的热稳定性（在95°C孵育60分钟后活性保持80%以上）和pH稳定性（pH5-10范围内活性良好）。差示扫描量热法测得VHH-II-3的熔解温度为138.53°C。

图2.纳米抗体的抗原结合能力与广谱性

VHHELISA实验表明，VHH-II-2和VHH-II-3对灭活细菌的检测限低于10^5CFU/mL。它们能特异性识别所测试的36株沙门氏菌（涵盖14种血清型）中的13种，但对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等五种非沙门氏菌无交叉反应，显示出良好的种属特异性。由于VHH-II-3在热分析中显示出更单一、协同的蛋白去折叠峰，表明其构象更稳定有序，因此被选为后续研究的对象。

图3.靶抗原的鉴定

通过His标签下拉实验结合质谱分析，鉴定出VHH-II-3结合的细菌蛋白。Westernblot和下拉实验证实，VHH-II-3能特异性结合分子量约为55kDa和35kDa的蛋白条带。质谱结果和后续验证表明，这两个条带分别对应鞭毛蛋白FliC（~55kDa）和FlgL（~35kDa）。VHHELISA进一步证实了VHH-II-3与纯化的FliC和FlgL蛋白的剂量依赖性结合。

图4.结合亲和力与关键残基分析

生物层干涉技术测得VHH-II-3与FliC的解离常数达到纳摩尔水平。通过丙氨酸扫描诱变，发现CDR3环中的Gln105是VHH-II-3与FliC结合的关键残基，该位点突变导致结合活性急剧下降。对于FlgL，尽管BLI未能直接检测到结合（推测因生物素化修饰影响了关键位点），但ELISA竞争实验测得半数有效浓度为~6nM。研究发现，CDR1的Asn28、CDR2的Asn54、CDR3的Gln118以及FR3区的多个赖氨酸残基对FlgL的结合至关重要。

图5.分子对接与结合机制

利用AlphaFold2预测了VHH-II-3的结构，并通过分子docking模拟了其与FliC和FlgL的相互作用。模型显示，VHH-II-3与FliC的结合界面主要由氢键和疏水相互作用稳定，关键残基包括Tyr103、Gln105和Phe116。而与FlgL的相互作用涉及更多氨基酸残基，分布在框架区和CDR环上，包括氢键、疏水作用和盐桥，这可能解释了其强结合信号。系统发育分析表明，与FliC相比，FlgL在多种沙门氏菌血清型中序列更为保守，这可能是VHH-II-3具备广谱识别能力的结构基础。

本研究成功从免疫噬菌体展示文库中筛选出能广谱识别13种沙门氏菌血清型的纳米抗体VHH-II-3。该纳米抗体具有优异的稳定性和亲和力。研究首次明确鉴定出鞭毛蛋白FliC和FlgL是其关键的靶抗原。结合机制研究表明，CDR3环中的Gln105是VHH-II-3与FliC高亲和力结合的关键残基；而与FlgL的强结合则涉及更多分散的残基协同作用。FlgL在沙门氏菌中的高度保守性，可能是赋予该纳米抗体广谱识别能力的分子基础。尽管VHH-II-3对活菌的结合较弱，这与其靶向的鞭毛蛋白在天然细菌表面的可及性有关，但本研究为开发基于纳米抗体的沙门氏菌广谱检测免疫分析技术（如免疫捕获、免疫传感器等）提供了有前景的核心识别元件，并深化了对纳米抗体-抗原识别机制的理解，对针对其他病原体的广谱抗体开发也具有借鉴意义。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5c07402