医疗相关感染（HAIs）是在医疗过程中获得、可造成严重医院内暴发流行的感染，严重威胁患者安全并增加医疗系统负担。其中，肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和嗜肺军团菌是导致HAIs的关键病原体，分别与多重耐药、血流感染和医院获得性肺炎相关。目前的检测金标准（传统微生物培养法）通常需要24-72小时，无法满足早期诊断和及时治疗的需求。聚合酶链式反应（PCR）灵敏度高但需要复杂的热循环仪和专业操作人员，限制了其在基层医疗和床旁检测中的应用。

环介导等温扩增（LAMP）与免疫层析检测（ICA）相结合的技术，为现场快速病原体检测提供了理想的平台。LAMP能在等温条件下（60-65℃）快速、高效地扩增核酸，而ICA则凭借其操作简单、成本低和可视读数的优点被广泛应用。然而，现有的LAMP-ICA技术仍面临几个关键瓶颈：1）灵敏度有限，传统胶体金探针的光学信号弱，难以检测低丰度病原体；2）检测时间长，扩增通常需要超过30分钟才能达到可检测水平；3）假阳性风险，开放式系统易产生气溶胶污染和交叉感染；4）成本较高，单次检测费用常超过10美元，限制了在常规临床POCT中的大规模应用。为突破这些限制，本研究致力于通过开发新型双信号纳米探针和全集成式微流控芯片，构建一个更快速、灵敏、可靠的床旁检测解决方案。

研究内容

图1.双信号Si@Au/DQD纳米探针的制备与表征

通过四步自组装法成功合成了硅-金/双量子点核壳纳米探针（Si@Au/DQDNPs）。该过程包括：在SiO2微球表面包覆聚乙烯亚胺（PEI）形成Si@PEI中间体；通过静电吸附依次负载金纳米颗粒和带负电的CdSe/ZnS量子点（QDs）；再包覆一层PEI；最后吸附第二层量子点。透射电镜、Zeta电位、元素映射等表征证实了材料从光滑SiO2到最终粗糙Si@Au/DQD结构的成功演变。该探针在526nm处有明显的表面等离子体共振吸收带（呈特征紫红色），在365nm激发下于628nm处有强荧光发射，并在60天内保持优异的化学和光学稳定性，为双模式检测奠定了基础。

图2.Si@Au/DQD探针的性能调控与优化

随着AuNPs负载量增加，颜色效应增强，但由于占据了QD的吸附位点，荧光强度呈现下降趋势。X射线光电子能谱证实了材料中C、Si、O、Au、Cd、S等元素的存在及化学状态。通过平衡比色效应与荧光强度，最终选择AuNPs负载量为0.25mg的Si@Au/DQDNPs作为标记材料，以实现理想的视觉筛查灵敏度和定量分析准确性。

图3.双模式LAMP-ICA微流控生物传感器的构建与优化

针对三种病原体（肺炎克雷伯菌phoE基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、嗜肺军团菌mip基因）设计了特异性LAMP引物组，并通过实时荧光LAMP验证了其高效扩增能力和特异性。在免疫层析试纸条上，测试线（T线）固定了抗地高辛或抗TAMRA抗体，质控线（C线）为羊抗鼠IgG。通过优化LAMP反应温度、引物浓度、缓冲体系、免疫标记体积、捕获抗体浓度及反应时间等关键参数，建立了三维（分子、免疫、器件）优化策略。所设计的微流控芯片集成了缓冲腔、扩增腔和检测腔，通过手动按压活塞驱动流体在密封系统内流动，有效防止了扩增产物的交叉污染。

图4.双模式LAMP-ICA微流控生物      传感器的灵敏度评估

为三种病原体设计了专用的微流控芯片组。在比色模式下，对三种病原体的视觉检测限分别为：肺炎克雷伯菌1.3×10³CFU/mL，金黄色葡萄球菌1.1×10³CFU/mL，嗜肺军团菌1.5×10³CFU/mL，优于传统胶体金系统。在荧光模式下，使用便携式荧光读数仪检测，灵敏度显著提高，仪器检测限分别为：肺炎克雷伯菌140CFU/mL，金黄色葡萄球菌82CFU/mL，嗜肺军团菌84CFU/mL，比传统AuNPs-LAMP-ICA系统灵敏度高出180倍以上。整个检测流程（15分钟LAMP扩增+15分钟ICA反应）可在30分钟内完成。

图5.双模式LAMP-ICA微流控生物传感器的实际性能评估

特异性测试表明，三种专用芯片仅对其对应的目标病原体产生信号，无交叉干扰，在混合样本中也表现出高特异性（RSD<2%）。重现性良好，批内和批间相对标准偏差均低于10%。在复杂的医院环境样本（床单拭子和呼吸机冷凝水）中进行加标回收实验，平均回收率在80.50%至117.23%之间，RSD在2.15%至11.97%之间，表明芯片在复杂基质中具有良好的准确度和重现性。对25份真实医院病房环境样本的检测结果与定量PCR结果具有高度一致性（肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的灵敏度/特异性均为100%/100%，嗜肺军团菌为94.7%/83.3%），证实了该平台的实用性和准确性。

本研究成功开发了一种用于检测三种关键HAI病原体（肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌）的双模式LAMP-ICA微流控生物传感器。其核心创新在于：1）材料创新：设计了新型Si@Au/DQD复合纳米探针，利用其“比色-荧光”双光学特性，实现了从“快速定性视觉检测”到“精确定量仪器分析”的灵活切换，荧光检测限低至82-140CFU/mL，灵敏度显著优于传统系统。2）系统集成创新：将LAMP扩增与ICA检测集成于密封的微流控芯片中，从根本上消除了传统开放式系统的扩增产物污染风险，总检测时间控制在30分钟/芯片内。此外，每次检测成本低于2美元，远低于同类检测。该工作通过材料与系统的集成创新，为HAI病原体的快速检测建立了一个稳健的平台。未来将整合片上核酸提取步骤，以实现全自动的“样本进-结果出”式床旁检测。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c05437