1.引言

食源性致病菌严重威胁公众健康，其中金黄色葡萄球菌（S. aureus）不仅普遍存在，还可在不利环境下进入“活的非可培养（VBNC）”状态，这种状态下的细菌虽无法通过传统培养法检测，却仍保留致病能力，对食品安全构成巨大隐患。现有的检测技术往往难以兼顾细菌的去除，且缺乏针对VBNC状态细菌的有效识别手段。因此，迫切需要开发一种既能灵敏检测又能高效清除复杂液态食品中活菌、死菌及VBNC菌的创新策略，以实现食品安全的早期预警和有效控制。

本研究开发了一种基于分子印迹技术的磁性纳米酶（MIP@B-CoFeO）技术，通过表面组分印迹法制备了核心为钴铁氧磁性纳米颗粒、外壳为聚多巴胺分子印迹聚合物的核壳结构材料。在试验方法上，研究首先合成具有过氧化物模拟酶活性的羧基化钴铁氧纳米酶（C-CoFeO），随后利用3-氨基苯基硼酸修饰获得pH响应型纳米酶（B-CoFeO），使其能在碱性条件下捕获金黄色葡萄球菌。接着，利用糖苷水解酶将细菌裂解为片段组分，并以此作为模板进行多巴胺自聚合形成外壳，最后通过酸洗去除模板获得印迹材料。该技术利用印迹空腔特异性识别细菌，同时通过磁分离实现快速富集与去除，有效解决了传统方法难以同时实现液态食品中低丰度细菌（特别是活的非可培养VBNC状态细菌）的特异性去除与免标记定量检测的问题。

2.结果与讨论

C-CoFeO纳米酶的合成与表征：利用溶剂热法合成磁性钴铁氧纳米酶，结合XRD、XPS与透射电镜表征其尖晶石晶体结构、Co/Fe元素价态及核壳形貌，优化前驱体配比获得高饱和磁化强度（42.8 emu/g）与过氧化物模拟酶活性，为后续功能化修饰提供磁分离基础与催化信号响应载体。

图 1 C-CoFeO纳米酶的过氧化物酶样活性：（a）鲁米诺/HO体系的催化反应，（b）TMB/H体系的催化反应。（c）不同质量FeCl·6HO条件下纳米酶的粒径分布及平均粒径。（d）纳米酶的磁滞回线。（e）纳米酶的XRD谱图。（f）C 1s、（g）O 1s、（h）Co 2p和（i）Fe 2p的XPS元素高分辨率谱图。

B-CoFeO纳米酶的pH响应性与识别机制：利用3-氨基苯基硼酸修饰羧基化钴铁氧纳米酶，结合紫外-可见光谱与Zeta电位表征其在碱性条件下对金黄色葡萄球菌细胞壁磷壁酸的特异性识别，优化pH至8.6，利用苯硼酸基团与顺式二醇结构的可逆共价结合，实现碱性捕获、酸性释放的智能响应，为后续分子印迹提供模板识别基础。

图 2 （a）紫外-可见光谱揭示了B-CoFeO纳米酶对腺苷和脱氧腺苷的识别能力。（b）利用CFU计数法，展示纳米酶识别金黄色葡萄球菌的示意图。（c）优化后的C-CoFeO/3-APBA质量比（n=3）；（d）优化C-CoFeO/3-APBA质量比后纳米酶的ζ电位。

MIP@B-CoFeO纳米酶的印迹层构建与形貌表征：利用糖苷水解酶处理金黄色葡萄球菌获取细胞壁碎片作为伪模板，结合多巴胺自聚合构建分子印迹层，通过透射电镜与X射线光电子能谱验证核壳结构成功形成，优化聚合时间至60 min，获得印迹因子为4.72的功能化纳米酶，证实其对目标菌具有高特异性识别与结合能力。

图 3 （a）MIP@B-CoFeO纳米酶的XPS全谱。元素高分辨率谱图分别为（b）B 1s，以及（c）N 1s。（d）纳米酶的TEM图像。（e）经MIP和NIP纳米酶处理后，残留的S。金黄色葡萄球菌经培养后，采用CFU计数法进行测定。（f）不同聚合时间纳米酶的印迹因子。荧光显微镜图像显示：（g）用SYTO9和碘化丙啶（PI）染色的溶液，（h）加入NIP@B-CoFeO纳米酶30分钟，以及（i）加入MIP纳米酶30分钟。（j）C、和纳米酶的扫描电镜图像。（k）纳米酶的平均粒径分布。

MIP@B-CoFeO纳米酶的选择性识别与特异性验证：利用荧光显微镜观察结合CFU计数法，验证印迹材料对金黄色葡萄球菌的特异性捕获能力，结果显示该材料能精准识别目标菌并有效排除大肠杆菌等非目标菌的干扰，证明印迹空腔成功构建，具备高选择性与实际复杂样本检测的应用潜力。

图 4 （a）采用CFU计数法，测定MIP@B-CoFeO纳米酶对混合溶液中金黄色葡萄球菌的特异性识别能力。从（b）溶液、（c）溶液以及（d）含有大肠杆菌的混合溶液中，获取纳米酶特异性识别的SEM图像。对含有（e）溶血性葡萄球菌和（f）超巴氏葡萄球菌的细菌溶液混合物中的特定识别进行分析。（g）采用CFU计数法，以鉴定NIP@BCoFeO、WMIP@BCoFeO及纳米酶对的识别能力。

图 5 针对MIP@B-CoFeO纳米酶催化TMB/HO体系的检测参数优化：（a）H浓度，（b）TMB浓度。针对纳米酶催化鲁米诺/H体系的检测参数优化：（c）H浓度，（d）鲁米诺浓度。（e）金黄色葡萄球菌浓度与纳米酶催化化学发光强度之间的相关性。（f）纳米酶催化652 nm处吸光度之间的相关性。（g）纳米酶的再生与再利用。（h）pH值对纳米酶特异性识别的影响。利用荧光显微镜检测B-CoFeO纳米酶在识别活/死细胞中的应用（i）溶液分别用SYTO9和碘化丙啶（PI）染色，以及（j）加入纳米酶孵育30分钟。（k）纳米酶在牛奶中的检测性能。

3.总结

本研究构建的MIP@B-CoFeO纳米酶技术展现出显著优势。该技术利用分子印迹技术实现了对金黄色葡萄球菌的高特异性识别，有效克服了传统方法在复杂食品基质中易受干扰的难题。同时，其核壳结构设计集成了磁分离与双模式检测功能，不仅能够高效富集和去除目标菌，还可实现从活菌到VBNC状态细菌的免标记定量检测，极大地提升了检测的灵敏度与实用性。此外，该材料具备优异的再生性和循环使用能力，显著降低了检测成本，为液态食品安全的即时监控提供了一种高效、经济且多功能的解决方案。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.173240