三标叉形探针+磁分离，实现超高灵敏无仪器快检

单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性致病菌，能在冷藏条件下生长，对免疫低下人群、孕妇、婴幼儿和老年人具有高致死风险，是各国法规严格控制的重点对象。传统培养法检测耗时长达数天，无法满足食品安全快速筛查的需求。环介导等温扩增技术因操作简便、无需热循环仪，成为现场快速检测的理想选择，但其存在假阳性风险，且与侧向流动检测联用时，灵敏度常低于荧光检测法。CRISPR/Cas系统，特别是Cas12a，能特异性识别并切割目标DNA，其激活后具有反式切割单链DNA探针的活性，可极大提高检测特异性。然而，传统的基于CRISPR的侧向流动检测方案中，非切割探针可能导致假阳性信号。

本研究引入了一种新型的叉形探针，其5'端带有三个荧光素标签，3'端带有生物素标签。当Cas12a被激活后，切割探针，释放带有三个标签的片段。该片段是侧向流动试纸条测试线形成信号复合物所必需的，从而确保了信号与目标浓度的直接正相关，并从根本上避免了非切割探针引起的假阳性。本研究旨在将LAMP、CRISPR/Cas12a与该叉形探针及侧向流动检测技术整合，开发一种用于李斯特菌的超灵敏、高特异性、无需复杂仪器的现场检测新方法。

研究内容

图1.侧向流动试纸条的制备与功能验证

成功制备了两种功能化侧向流动试纸条：LFT-LAMP用于检测双标记的LAMP扩增子，测试线固定链霉亲和素；LFT-CRISPR用于检测被Cas12a切割的叉形探针，测试线固定抗荧光素抗体。两者使用相同的金纳米颗粒-抗荧光素抗体复合物。对金纳米颗粒及其抗体复合物进行了表征，平均直径约为28.9nm，偶联抗体后尺寸增大。功能测试表明，LFT-LAMP能检测0.4-10nM的双标记寡核苷酸，LFT-CRISPR能检测0.6-50nM的叉形探针，证明了两种试纸条的设计可行性。

图2.LAMP结合侧向流动检测的分析性能评估与优化

针对hlyA基因，测试了两套LAMP引物组，均显示出对李斯特菌的特异性。为进行LFT检测，在引物上引入荧光素和生物素标记。在12种标记组合中，筛选出信号最强的三种。然而，LAMP-LFT方法的灵敏度受限于高信号变异性，在低于2×10^4拷贝/反应时信号不稳定，视觉检测限为2×10^4拷贝/反应。相比之下，荧光检测的灵敏度更高。研究表明，标记引物的引入可能抑制LAMP反应，且LAMP扩增产物的异质性可能导致标记物可及性不同，从而影响了LFT检测的稳定性和灵敏度。

图3.LAMP-CRISPR/Cas12a-侧向流动检测方法的开发与表征

将LAMP与CRISPR/Cas12a结合，针对hlyA-1引物组设计了gRNA-1。在荧光检测模式下，对双链DNA靶标的检测限达到0.9拷贝/反应，灵敏度比单独的CRISPR或LAMP大幅提高。将该系统与叉形探针及LFT-CRISPR试纸条联用。Cas12a识别并切割LAMP扩增子后，激活其反式切割活性，将叉形探针切割，释放带三个荧光素标签的片段，经磁珠去除未切割探针后，上清液用于LFT检测。该方法实现了0.9拷贝/反应的视觉检测限，比LAMP-LFT灵敏度提高了20,000倍，且与荧光检测结果高度一致。该方法对李斯特菌具有高特异性。

图4.对细菌细胞的检测性能及在实际样品中的应用

使用简单的热裂解法处理样品。在缓冲液中，该方法可检测低至0.2个细胞/反应的李斯特菌，总分析时间约80分钟。在加标牛奶样品中，5倍稀释可有效消除基质抑制，检测限约为1个细胞/反应。通过对18份阳性加标牛奶样本的检测，回收率达到89.9%。该方法首次实现了在真实食品基质中使用叉形探针的LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT检测。

本研究成功开发了一种用于单核细胞增生李斯特菌无设备、高灵敏检测的LAMP-CRISPR/Cas12a-侧向流动检测方法。该方法整合了LAMP的快速扩增能力、CRISPR/Cas12a的高特异性识别与信号放大能力，以及一种新型叉形探针。该探针的设计确保只有被Cas12a切割的片段才能在侧向流动试纸条的测试线产生信号，从而实现了信号与目标浓度的直接关联，并有效避免了假阳性。在最优条件下，该方法在缓冲液中对细菌细胞的检测限达0.2个细胞/反应，在加标牛奶中经5倍稀释后检测限约为1个细胞/反应，总分析时间约80分钟。该方法对李斯特菌显示高特异性，无交叉反应。尽管在无需任何样品前处理的情况下，其灵敏度尚不能完全满足现行最严格的“零容忍”法规对25g样品检测的要求，但该方法为食品安全现场快速筛查提供了一种极具前景的强大工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodres.2026.118592