可编程纸芯片：CRISPR级联反应实现多重病原体检测

原创

来源：占英

2026-03-27 16:19:41

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核心提示：本文开发了一种基于Cas12a可编程模块化级联反应的纸基光学生物传感平台，利用荧光DNA模板银nm簇作为信号探针，成功实现了对空肠弯曲菌、产志贺毒素大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌三种主要细菌病原体基因组的双模式（开-关信号和开信号保留）检测。

由病原体引起的疾病是全球健康的重要威胁，特别是空肠弯曲菌、产志贺毒素大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌等食源性致病菌，可导致严重的健康后果和经济负担。开发快速、低成本、适用于现场（特别是资源有限地区）的检测平台对于早期诊断和预防疾病传播至关重要。CRISPR-Cas12a技术通过其高度特异性的靶向识别能力和靶标激活的非特异性单链DNA切割活性，为核酸生物传感带来了革命性进步。然而，传统的检测方法（如使用荧光-猝灭剂标记的探针）成本较高，且通常需要在液相中进行复杂操作，限制了其在低成本、便携式诊断中的应用。固体支持基质（如纸）具有低成本、易于制造、通过毛细作用富集反应物等优势，是理想的现场检测平台，但在其上实现复杂的多步酶促反应仍面临挑战。荧光DNA模板银nm簇是一种无需标记、具有固有荧光的探针，其荧光在DNA支架被降解时消失，非常适合作为CRISPR-Cas12a激活的信号报告分子。然而，其信号模式通常是靶标存在时荧光消失（“开-关”），这在直观性上存在不足。

本研究旨在解决这些挑战，开发一种直接在纸基质上运行、可进行多重检测、并能灵活输出“开-关”或“开信号保留”模式的低成本、可扩展的生物传感平台。

研究内容

图1.在纸基质上验证FNPs作为酶活性报告分子

研究者首先验证了在纸基质上使用FNPs作为酶活性报告分子的可行性。他们合成了平均尺寸约150nm的FNPs，并将其沉积在约5毫米的字母“D”形滤纸基片上。当在基片上直接加入DNase I酶时，FNPs的荧光在20min内显著消失，而未加酶的对照组荧光保持稳定。通过荧光光谱和图像分析定量证实了荧光的减少。该实验表明，FNPs能够有效地在纸基上报告核酸酶活性，为后续的CRISPR-Cas12a检测奠定了基础。

图2.Cas12a驱动的纸基单靶标检测

研究将CRISPR-Cas12a系统整合到纸基平台，构建了用于多重检测的传感器阵列。他们制备了分别代表空肠弯曲菌、产志贺毒素大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌的“C”、“E”、“L”形字母纸基传感器。每个传感器预先加载了针对特定病原体保守基因区的Cas12a-crRNA复合物和FNPs。当阵列分别暴露于单一靶标时，只有对应的字母传感器发生了荧光损失，而其他传感器和参比字母“R”（仅含FNPs）的荧光保持不变。荧光图像、热图分析和动力学测量均证实了平台具有高度的特异性，能够准确地识别和响应单个靶标基因组。

图3.多重病原体基因组的同步检测

为了评估平台在复杂样本中的实用性，研究者测试了其同时检测多种靶标的能力。他们将传感器阵列暴露于所有可能的两种和三种靶标混合物中。结果显示，在每一种组合下，只有那些存在对应靶标的字母传感器发生了荧光损失。例如，在同时含有空肠弯曲菌和大肠杆菌靶标的样本中，只有“C”和“E”传感器荧光减弱，“L”传感器信号保留。即使在三靶标混合物中，阵列也能准确无误地指示出所有三种靶标的存在，实现了100%准确率的同步多重检测，证明了该平台在复杂环境样本分析中的鲁棒性。

图4.通过两步CRISPR反应实现信号反转

在第一阶段，靶标激活第一个Cas12a，切割一个激活剂链。该激活剂链原本用于激活第二个通用Cas12a反应来降解FNPs。因此，当靶标存在时，激活剂被切割，第二个反应被抑制，FNPs和荧光得以保留（“开信号保留”）；当靶标不存在时，激活剂完整，触发第二个反应降解FNPs，导致荧光消失。该设计成功应用于单靶标、双靶标和三靶标的检测，在靶标存在的对应传感器上实现了荧光保留，验证了该反向信号平台的有效性和特异性。

图5.全基因组检测与性能比较

他们使用重组酶聚合酶扩增对基因组中的保守区域进行等温扩增，然后将扩增产物用于两种信号模式（“开-关”和“开信号保留”）的检测。结果表明，在两种模式下，平台均能可靠地检测到低至40个基因组拷贝。研究还将自行合成的FNP探针与传统荧光-猝灭剂探针进行了比较，结果表明两者灵敏度（~10^-17 M vs ~10^-18 M）和检测时间（~180min vs ~130min）相当，但FNP探针因使用无标记DNA，在DNA成本（0.1美元/纳摩尔 vs 1.3美元/纳摩尔）和单次反应探针成本（0.4美分 vs 1.6美分）上具有显著优势，凸显了其成本效益和可扩展性。

本研究成功开发了一种低成本、可扩展的纸基光学生物传感平台。该平台利用荧光DNA模板银nm簇作为信号报告分子，结合可编程的CRISPR-Cas12a系统，直接在滤纸字母形基片上实现了对三种主要细菌病原体（空肠弯曲菌、产志贺毒素大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌）基因组的特异性检测。平台不仅能够以“有靶标-荧光消失”的模式准确完成单靶标和多靶标的同步检测，还通过创新的两步Cas12a级联反应，实现了更符合诊断直觉的“有靶标-荧光保留”信号输出模式，展现了高度的模块化和灵活性。重要的是，该平台能够检测经等温扩增后的完整细菌基因组，灵敏度可达40个拷贝，并与传统探针性能相当，但在成本上更具优势。