固相等温扩增结合SERS拉曼指纹的mecA灵敏定量检测平台

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及其他耐药病原带来持续的公共卫生压力，临床亟需一种兼具快速、灵敏与高特异的耐药基因检测手段，以缩短等待时间并优化抗菌药物使用。等温扩增中的RPA具有反应快、灵敏且便携等优势，适合资源受限环境，但仍存在引物设计要求高、扩增产物气溶胶污染风险与成本等问题，单独应用时在复杂样本中也易受背景干扰。SERS则能提供分子“指纹”信息并显著提升拉曼信号强度，可在低浓度核酸背景下实现更低检测限与更可靠识别。基于此，本研究提出磁珠表面原位RPA实现固相扩增与产物富集(提高信号源浓度)，再与SERS读出联用(增强识别度/可定量性)，力图在无需精密温控设备的条件下满足临床对MRSA耐药基因mecA快速筛查的需求，为基层与资源受限场景的即时检测提供可转化的技术路径，同时为后续多靶标扩展奠定基础。

一、设计原理

①总体构想:本研究将检测流程拆分为“磁珠原位RPA实现信号扩增与富集”和“SERS拉曼实现特异识别与读出”两部分，并在同一反应体系内按顺序完成，从而避免对PCR热循环设备的依赖，实现更快捷的耐药基因检测（图1）。

②磁珠原位扩增与富集:首先将生物素化上游引物通过生物素-链霉亲和素体系固定到磁珠表面，使磁珠成为RPA反应位点；在37-42℃恒温条件下，目标DNA在较短时间内被扩增，同时扩增产物被限制并富集在磁珠表面，随后可通过磁分离与洗涤去除样本基质与游离成分，降低背景干扰并为后续光谱检测提供更充足的信号源。

③SERS特异读出:引入银包金纳米星SERS标签，并以4-MBA作为拉曼报告分子；原位扩增后的磁珠与SERS标签通过金-硫键连接形成复合物，多余SERS标签经磁分离被去除，最终采集富集磁珠表面被增强的特征拉曼信号，实现对mecA耐药基因的快速判定与定量分析。

图1  基于磁珠原位RPA与SERS联用的mecA基因检测流程示意图。

二、方法性能

本研究的方法性能可从分析学性能与临床性能两部分展开说明。

首先，灵敏度与定量能力方面，如图2A-C所示，对MRSA目标DNA进行梯度稀释后，1071 cm⁻¹特征峰强度随浓度升高而增强，并在2.2×10⁻¹至2.2×10⁴ pg/μL范围内呈良好线性关系，R²=0.99，表明该方法具备宽线性定量区间。同时，检出限按LOD=3σ/slope计算，得到0.189 pg/μL，其中σ来源于20个空白样本读数的标准差，说明评价采用了规范的统计定义。其次，特异性方面，如图2D-E所示，将肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等作为对照，仅MRSA产生显著拉曼信号，其余对照无明显响应，提示该体系对目标具有良好排他性，可降低交叉反应导致的误判风险。再次，重复性与稳定性方面，如图2F所示，作者使用不同批次SERS探针进行测试，用于验证批间一致性与读数可比性，为阈值判读与临床应用提供稳定性支撑。

临床诊断性能方面，如图3A-C所示，在32例临床样本中，ROC曲线AUC=0.81，表明具有较好的区分能力；同时设定Cut-off=5670 a.u.作为临床判读阈值，用于实现阳性与阴性的二分类判定。在与临床常用金标准质谱联合药敏试验对照时，敏感度为80%，特异度为94.12%。一致性与误差类型方面，如图3D-E及表1所示，对21例样本进行一致性分析，阳性与阴性信号差异具有统计学意义，P=0.0002，且Kappa=0.71，提示与药敏结果具有较高一致性。表1列联表进一步显示：药敏阳性9例中，本方法检出8例、漏检1例；药敏阴性12例中，误报2例、正确阴性10例。由此得到OPA=85.7%，PPA=80.0%，NPA=90.9%，说明该方法具备一定临床可用性基础，但仍需扩大样本量并开展多中心验证，以稳定阈值并减少不一致样本比例。

图2  磁珠原位RPA-SERS体系用于mecA检测的分析学性能评估。

图3  临床样本中磁珠原位RPA-SERS方法对MRSA(mecA)的诊断效能与一致性评估。

表1  RPA-SERS方法与细菌药敏试验在临床样本中的结果对照与一致性指标。

综上，本研究提出磁珠表面原位RPA扩增富集结合SERS拉曼读出的一锅式策略，实现mecA的快速定量检测，体现了固相等温扩增与光谱读出的集成创新。但其当前仅针对mecA单靶标，缺少对金黄色葡萄球菌的物种鉴定模块，因此更适用于在已确认金葡背景下的耐药快速筛查，而非对未知病原的一步诊断。未来应通过多色SERS编码或多重RPA引入金葡鉴定靶标(如clfA等)并与mecA同管检测，结合封闭式微流控实现闭管样本进结果出，同时扩大多中心样本验证以稳定阈值并提升POCT可迁移性。

 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2026.139440