抗生素耐药细菌对全球公共卫生构成严重威胁，预计到205年将导致全球1000万人死亡。其中，甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌和产KPC-2肺炎克雷伯菌是医院获得性感染的主要病原体。传统检测方法包括微生物分离培养和基于核酸扩增的分子诊断技术，但通常操作复杂、耗时长、难以实现多重检测和定量，限制了其在现场监测和在资源有限地区的应用。因此，迫切需要一种快速、灵敏、特异的方法来同时检测多种耐药菌，以实现及时的靶向临床治疗。适配体作为生物传感器中的理想识别元件，具有易于获取、成本低、热稳定性好等优点。CRISPR/Cas系统可以将分子识别事件与荧光信号直接线性关联。其中，Cas12a在特异性识别与crRNA互补的DNA后，可非特异性切割单链DNA分子信标，产生荧光信号。然而，仅靠CRISPR/Cas系统检测能力有限，与核酸扩增模块结合可提高检测的灵敏度、特异性和可靠性。

熵驱动催化是一种基于单链DNA和双链DNA复合物之间构象熵驱动的分支交换和分支迁移反应的无酶动态DNA反应网络，可在无需预先提取核酸的情况下触发信号放大。将CRISPR/Cas系统与EDC结合，有望显著提高耐药菌检测的灵敏度和准确性。此外，与常规荧光分子相比，持久发光纳米颗粒在激发停止后仍可发射持久磷光，无需外部照明，且具有更强的紫外吸收、更大的发射位移和优异的光稳定性，是理想的荧光探针。结合微流控技术高效、低试剂消耗、可集成的优势，本研究旨在开发一种集适配体识别、EDC循环、CRISPR/Cas12a系统和PLNPs探针于一体的便携式多重微流控芯片，以实现多种耐药菌的快速、高灵敏度现场检测。

研究内容

图1.PSDA平台的设计原理与锁定激活剂的性能

PSDA平台由三部分组成：1）被“锁定”的DNA激活剂（由适配体和DNA激活剂组成）在目标耐药菌存在时解离，释放DNA激活剂；2）释放的激活剂触发EDC循环，产生大量单链DNAS2，进而激活Cas12a的反式切割活性；3）活化的Cas12a切割固定在持久发光纳米颗粒表面的报告探针，恢复荧光信号。该平台集成了3D打印反应器和可视化工具。实验证明，针对三种耐药菌的锁定激活剂（LA-M,LA-P,LA-K）均能特异性识别其目标菌，而对敏感菌株及其他非目标致病菌（如单增李斯特菌、大肠杆菌等）无交叉反应，显示出高特异性。

图2.CRISPR/Cas12a传感器的可行性验证与优化

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和热力学计算验证了DNA激活剂触发EDC循环的可行性。优化了EDC循环中S2序列的长度（19nt为最佳）以及与crRNA互补的FuelF序列长度（10nt，以防止其激活Cas12a）。与单独的CRISPR/Cas12a系统相比，整合了EDC循环的传感器在检测三种耐药菌时，信号强度随时间显著更高，证明EDC循环有效放大了信号。

图3.持久发光纳米探针ZGM@BHQ1的制备与表征

采用溶剂热法合成了棒状Zn2GeO4:Mn纳米颗粒，长度主要在60-100nm之间，具有高结晶度。通过氨基硅烷化和Sulfo-SMCC交联，成功将cDNA-BHQ1共价连接到ZGM表面，形成ZGM@BHQ1探针。透射电镜、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱、动态光散射和Zeta电位等表征证实了材料的成功合成与功能化。ZGM在254nm激发下发射532nm的绿光，其绝对荧光量子产率为8.78%。BHQ1对ZGM的荧光淬灭率达到86.4%。与常规荧光染料5-FAM相比，ZGM在连续LED光照72小时后荧光强度保持稳定，显示出优异的抗光漂白稳定性。

图4.ZGM@BHQ1探针的传感器灵敏度与性能

使用ZGM@BHQ1作为分子信标，评估了传感器对三种耐药菌的检测性能。在1-10^7CFU/mL的宽动态范围内，荧光强度与细菌浓度呈良好的线性关系，检测限低至1CFU/mL。线性回归模型决定系数R²均高于0.99。与常用的FAM-BHQ1和ROX-BHQ2探针相比，ZGM@BHQ1具有更低的检测限和更高的信背比。此外，ZGM@BHQ1探针在30分钟内信号达到稳定，提供了比FAM-BHQ1探针更短的响应时间。

图5.微流控芯片与3D打印便携式设备的设计与优化

通过AutoCAD设计模具，采用聚二甲基硅氧烷软光刻技术制备了嵌入式微流道的微流控芯片。集成的3D打印便携设备包含温控反应腔和光学检测单元，由充电锂电池供电。反应完成后，使用智能手机定制APP采集芯片荧光图像，并提取绿色通道值进行定量分析。对锁定激活剂浓度、双链复合物S浓度、FuelF浓度和crRNA浓度等关键参数进行了优化，确定了三种细菌检测各自的最佳条件。

图6.PSDA平台的多重检测性能与特异性

在优化条件下，PSDA平台成功建立了同时检测三种耐药菌的标准曲线，检测限均为1CFU/mL，总检测时间约45分钟。与实时荧光定量PCR相比，PSDA平台灵敏度更高、检测更快、成本更低（单次检测成本约1.67美元）。平台显示出良好的重复性、重现性，冻干试剂在4°C储存28天后活性保持率超过92.5%。特异性测试表明，平台可准确区分单一或混合的耐药菌。

本研究成功开发了一种名为PSDA的便携式微流控生物传感器，用于三种重要耐药菌（MRSA,CRPA,KPC-2KP）的超灵敏、快速、同时检测。其创新之处在于：1）利用特异性适配体锁定激活剂识别细菌，触发无酶的熵驱动催化循环进行信号放大，再通过CRISPR/Cas12a系统将信号转化为荧光输出，实现了从非核酸靶标到荧光信号的正相关转换；2）设计并合成了新型持久发光纳米颗粒探针ZGM@BHQ1，其优异的抗光漂白稳定性和高信背比进一步提升了检测灵敏度（1CFU/mL）和可靠性；3）将整个检测系统集成于3D打印的便携设备中，结合智能手机进行读数，实现了现场快速检测（~45分钟），且成本低廉。该平台在多种实际食品和临床血液样本中均表现出优异的准确性、特异性和稳健性。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.5c03012