1.引言

致病菌污染严重威胁食品安全、环境安全与公共卫生，全球每年因致病菌感染致死人数超 42 万。传统平板培养法耗时费力，PCR 技术操作复杂，而荧光、拉曼、电化学等方法依赖大型设备，难以在资源有限场景普及。

化学发光因无激发光干扰、灵敏度高、仪器简单成为理想检测手段，但传统化学发光免疫分析需复杂洗涤分离，LOC I 技术易出现提前发光，信噪比与稳定性不足。

基于单线态氧（¹O₂）在水中仅约 268 nm 的短扩散距离，以及¹O₂/H₂O₂双激活化学发光前体分子，本研究构建 PALCA 均相检测体系，以大肠杆菌为模式菌，实现免分离、免洗涤、快速、超灵敏致病菌检测，为革兰氏阴性菌现场筛查提供全新策略。

2.结果与讨论

1 纳米探针表征（图 1、图 2）

化学发光报告探针（CPM@PS@PMB）：

聚苯乙烯纳米球粒径均匀，负载前体并修饰多黏菌素 B 后形成透明表层；

UV‑vis、FT‑IR 证实 PMB 成功修饰，酰胺键特征峰明显；

水合粒径由 192 nm 增至 269 nm，Zeta 电位由‑18.3 mV 变为 + 37.2 mV，界面性质显著改变。

单线态氧发生器（PCN‑224@AMP）：

PCN‑224 卟啉 MOF 为球形均匀结构，修饰抗菌肽 AMP 后表面形成纳米层；

FT‑IR、UV‑vis 证实 AMP 成功负载，晶体结构与光学性能保持稳定；

光照下高效产生单线态氧，30 分钟内 ABDA 吸光度下降超 50%，光稳定性优异。

2 可控化学发光性能验证（图 1、图 3）

仅在光照产生 ¹O₂ + 添加 H₂O₂双条件下，才出现强化学发光信号，实现严格可控发光；

发光信号持久稳定，40 分钟内无明显衰减，背景信号极低；

最优条件：白光照射 4 分钟、探针浓度 CPM@PS@PMB 3.1×10⁸ pcs/mL、PCN‑224@AMP 0.16 μg/mL、pH 7.4。

3 检测机理与特异性验证（图 4）

仅当两种纳米探针同时结合到细菌表面，距离缩短至单线态氧有效扩散范围，才能激活前体分子，加入 H₂O₂后产生强光；

对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性菌强响应；

对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等革兰氏阳性菌几乎无信号，特异性优异；

对照实验缺失任一组件均无明显信号，验证机理可靠性。

5 实际样品检测（表 1）

在灭菌牛奶、湖水等复杂基质中：

加标回收率96.2%–106.7%；

不受基质干扰，检测结果准确可靠；

全程仅需30 分钟，无需洗涤分离，适配现场快检。

3. 增强机制与性能优势

邻近激活机制：细菌作为 “桥梁” 拉近双探针距离，限定单线态氧作用空间，大幅降低背景、提升信噪比。

双控发光设计：¹O₂预激活 + H₂O₂触发，避免自发发光，信号可控性与稳定性显著提升。

纳米材料增效：卟啉 MOF 高产单线态氧，聚苯乙烯纳米球高效负载前体，双重放大信号。

全流程极简：均相反应、免洗涤、免分离、单管完成，操作简单、速度快、成本低。

4. 总体结论

本研究成功构建邻近单线态氧激活可控化学发光（PALCA） 检测体系，用于革兰氏阴性致病菌超灵敏快速检测。

以双探针邻近识别为核心，结合 ¹O₂/H₂O₂双激活化学发光，实现均相免洗涤检测；

对大肠杆菌检出限1.8 CFU/mL，线性范围宽、特异性强、重复性好；

30 分钟完成检测，在牛奶、湖水等实际样品中回收率优异；

可通过更换识别分子拓展至其他细菌，通用性强。

该技术突破传统方法耗时、复杂、需大型仪器的局限，兼具超灵敏、快速、简便、低成本优势，在食品安全监测、环境水体检测、临床即时诊断、现场病原筛查等场景具有重大应用价值，为致病菌快速检测提供革命性解决方案。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c07323