DNA步行器级联CRISPR，构建超灵敏AFB1荧光传感器

黄曲霉毒素B1（AFB1）是黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，被国际癌症研究机构列为I类致癌物。目前，传统的真菌毒素检测方法（如高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法）通常存在诸多局限性，例如设备昂贵、需要专业操作人员，且不适合大量样品的快速现场检测，限制了其广泛应用。近年来，基于荧光、比色和电化学等技术的便携式快速检测生物传感平台得到了发展。当目标DNA被识别后，Cas12a蛋白的反式切割活性被激活，可非特异性切割任意单链DNA。该技术是提高荧光生物传感器灵敏度的理想工具，但其在传统模型中通常采用“一对一”模式，即单个目标释放一个激活剂来激活一个CRISPR/Cas12a反应。为了提高检测的灵敏度和适用性，CRISPR/Cas12a常与核酸扩增方法联用。它由步行链、步行轨道和驱动力三部分组成，利用核酸内切酶的强催化特性实现自主定向移动，仅用一个目标即可触发数百次循环放大，为提升检测灵敏度提供了有利基础。

基于此，本研究旨在整合3DDNA步行器的信号放大能力、CRISPR/Cas12a的高特异性识别与信号转导特性，以及DNA-银纳米簇无标记探针的优异荧光性能，构建一个用于AFB1超灵敏检测的新型适配体生物传感器。

研究内容

图1.传感平台工作原理

该生物传感器的原理包含两部分：DNA步行器过程和CRISPR/Cas12a精确调控DNA-银纳米簇的荧光响应。首先，AFB1被适配体特异性识别，少量AFB1通过3DDNA步行器过程释放大量激活剂。这些激活剂激活Cas12a的反式切割活性，切割用于合成DNA-银纳米簇的探针（由C富集模板序列和可自组装成G-四链体的G富集序列组成），导致荧光信号降低。具体而言，在链霉亲和素磁珠表面，设计了底物链和步行链，其中步行链与锁定链互补。AFB1引入后，与锁定链结合，使其从双链结构解离，释放出的步行链进一步与底物链杂交。新形成的短互补区域被Nb.BbvCI特异性切割，释放出激活链。通过DNA步行器的持续行走过程，磁分离后的上清液中富集了大量激活剂。激活剂与crRNA特异性结合进一步触发Cas12a的反式切割活性，使其切割包裹银纳米簇的DNA序列，分解成DNA片段，导致G-四链体结构解离，荧光强度显著下降。

图2.DNA-银纳米簇的表征

使用G富集DNA模板、硝酸银和硼氢化钠在磷酸盐缓冲液中合成了发光的DNA-银纳米簇。通过圆二色光谱证实DNA模板有效折叠，显示出反平行G-四链体结构的特征。在510nm激发下，DNA-银纳米簇在570nm处有最大发射，表明其成功合成并具有可用荧光特性。透射电镜图像显示所制备的银纳米簇呈球形且均匀分散的点状结构。动态光散射测得的平均尺寸约为3.62nm，与高分辨透射电镜观察结果一致。时间扫描荧光曲线显示，在Cas12a切割过程中，DNA-银纳米簇的荧光强度随时间逐渐降低，并在40分钟后趋于稳定。

图3.传感平台的可行性分析

为验证DNA步行器和所构建生物传感器的可行性，将磁珠表面的底物链替换为FAM标记的底物链。等温滴定量热法测得AFB1适配体的解离常数为75.2nM，确保了AFB1与锁定链的有效结合，是DNA步行器工作的基础。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，AFB1成功识别了锁定链；加入AFB1后，解锁的步行链持续移动并与底物链结合，形成Nb.BbvCI的识别位点，导致消化片段释放。荧光实验表明，当目标AFB1和Nb.BbvCI均存在时，DNA步行器有效工作，释放出大量FAM标记的激活剂。在CRISPR/Cas12a反应中，当AFB1存在时，DNA步行器高效进行，释放的大量激活剂激活Cas12a，使其非特异性切割包裹银纳米簇的G富集DNA序列，导致570nm处的荧光强度显著下降。4%琼脂糖凝胶电泳进一步验证了基于“锁定激活”模式的反式切割效应。综上所述，实施DNA步行器策略以激活CRISPR/Cas切割系统是可行的。

图4.实验条件优化

随着底物链比例增加，释放的消化片段增多，直至步行链与底物链浓度比达到1:12时荧光强度降至最低。随着Nb.BbvCI浓度从0增至2U/μL，荧光强度持续下降，在2U/μL时达到最小。Cas12a-crRNA浓度从0nM增至40nM时，荧光强度逐渐降低并趋于稳定，故选择40nM。Cas12a切割时间从0min增至45min时，荧光强度逐渐降低并稳定，故选择45min。当DNA-银纳米簇浓度为6μM时，荧光响应达到峰值，故后续实验选用此浓度。

图5.分析性能、特异性、抗干扰、储存稳定性与重现性

在最优条件下，该生物传感平台用于检测不同浓度的AFB1标准品。当AFB1存在时，Cas12a被激活，降解DNA探针并抑制荧光DNA-银纳米簇的形成，导致570nm处荧光信号强度显著降低。随着AFB1浓度增加，系统的荧光强度逐渐降低，在10ng/mL后逐渐稳定。在0.05-10ng/mL范围内，570nm处的荧光强度与AFB1浓度的对数呈良好的线性关系。根据3倍标准差与斜率之比计算得到的检测限为45.38pg/mL。与商品化ELISA试剂盒（检测范围0.1-2ng/mL）相比，该方法具有更宽的检测范围和更低的检测限。与已报道的多种AFB1检测方法相比，该方法显示出高灵敏度和低检测限，这可能得益于DNA步行器的有效放大、Cas12a优异的反式切割活性以及DNA-银纳米簇出色的发光性能。

为验证选择性，检测了其他真菌毒素（FB1,OTA,T-2,ZEN,DON）及其混合物。由于适配体对AFB1的高亲和力和特异性，仅在AFB1存在时荧光衰减显著，其他潜在干扰毒素的荧光响应接近空白信号。当AFB1与其他毒素共存于混合物中时，荧光衰减程度与单独AFB1时相同，表明多种非目标毒素共存不干扰AFB1检测。对可能存在于食品基质中的干扰物（如蛋白质、脂肪）进行检测，5ng/mLAFB1的荧光响应最强，而0.5ng/mL干扰物的信号可忽略，表明该生物传感器可消除常见食品基质干扰物的影响。在最佳条件下制备六个相同样品，检测10ng/mLAFB1，响应高度一致，相对标准偏差为1.79%。将制备的生物传感器在4℃避光储存16天，每4天测量一次荧光，储存16天后仍保留了78.8%至82.4%的原始荧光强度。结果表明，所构建的生物传感器具有高重现性、储存稳定性、特异性和抗干扰能力。

综上所述，基于DNA步行器放大和CRISPR/Cas12a精确调控的DNA-银纳米簇荧光响应，我们构建了一种用于AFB1检测的超灵敏无标记荧光生物传感器。该方法利用了Cas12a的特异性识别和独特的信号转导特性、适配体的精准识别以及无标记DNA-银纳米簇荧光探针的优异荧光特性，具有出色的特异性、高灵敏度和卓越的稳定性。所构建的生物传感器在0.05-10ng/mL的宽线性范围内对AFB1的检测限低至45.38pg/mL。此外，该生物传感器可用于检测食品样品中的AFB1，回收率令人满意（93.39%-106.62%）。所构建的生物传感器不仅实现了食品安全领域的简单、精确检测，也为设计和开发基于CRISPR/Cas的生物传感器用于检测其他真菌毒素提供了新思路。通过更换适配体序列，所提出的创新方法可实现对不同真菌毒素的通用检测。此外，该方法不仅限于真菌毒素的检测，也为超灵敏检测其他生物分子（如小分子、蛋白质和核酸）提供了新的启示。本研究通过优化步行链的长度和序列位置，有望有效促进DNA步行器的反应过程，进一步提高检测灵敏度。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2026.150549