感染性疾病在急性医疗中威胁巨大，病原体快速鉴定与药敏结果直接影响预后与耐药防控。但传统培养虽为金标准，鉴定与药敏常需18至24小时以上；MALDI-TOF可快鉴定却仍依赖培养且难以直接药敏；核酸扩增方法灵敏但样本处理繁琐，易受抑制并有污染风险。诊断延迟促使经验性广谱用药，增加不良反应并加速耐药扩散。FISH可无扩增直接检测核酸靶标，却受固定与洗涤耗时、显微判读依赖及单细胞灵敏度不足限制；PNA探针虽改善穿透，但核心流程未变且自动化整合不足。为兼顾无扩增优势与极速检测需求，本研究提出SWIFT-FISH，通过瞬态热通透、微流控连续流检测与机器学习辅助分类的三重创新，构建了集细菌鉴定与药敏试验于一体的快速诊断平台（图1）。

一、工作原理

图1以示意图形式完整呈现了SWIFT-FISH技术的三大核心功能模块，系统展示了该诊断平台从样本处理到结果输出的全流程设计逻辑及其解决的临床问题。

基础细菌鉴定流程：细菌样本与PNA探针混合后，经95°C热通透处理2分钟，探针进入胞内与16S rRNA杂交；随后样本加载至微流控芯片，在LIF检测区产生特征荧光峰。整个流程仅需5分钟，突破了传统FISH需化学固定和多次洗涤的耗时瓶颈，实现了"热破壁-杂交-检测"的一体化快速分析。

快速药敏试验：将细菌与抗生素共孵育55分钟后进行SWIFT-FISH检测：耐药菌持续增殖导致荧光峰数量显著增加，敏感菌受抑制则峰数维持低水平。该设计将表型药敏检测时间从传统18-24小时压缩至约1小时，解决了培养依赖型AST无法满足临床急迫需求的痛点。

多菌种分类策略：三种广谱PNA探针（BP1/BP2/BP3）因与不同菌种16S rRNA的互补性差异，产生独特的峰数比率与通道重合频率特征，形成可区分的时空荧光指纹。该策略突破了"一探针对一菌种"的传统设计局限，以最小探针组合实现多物种精准鉴定。

图1  :SWIFT-FISH总体概览

二、病原鉴定

方法学验证显示，该技术动态范围跨越10³–10⁷ CFU/mL，10分钟检测限达10³ CFU/mL，覆盖临床尿感菌量范围（图2）。针对多菌种鉴定，研究采用"3探针6菌种"策略：BP1/BP2/BP3三种广谱PNA探针因与不同菌种16S rRNA亲和力差异，产生独特峰数比率与通道重合频率特征。机器学习辅助下，Fine Gaussian SVM算法实现6种致病菌99.12%分类准确率（图3）。临床尿液样本验证中，14例样本（5阴性9阳性）与培养法一致性达13/14，3种阳性菌种（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌）分类准确率100%（图4），证明直接检测原始临床样本的可行性。

图2  SWIFT-FISH方法建立与性能表征。

图3  多色SWIFT-FISH菌种分类鉴定。

图4  临床尿液样本SWIFT-FISH检测。

三、AST分析

基于单细胞增殖定量能力，SWIFT-FISH将表型AST压缩至约1小时：细菌与抗生素孵育55分钟后检测，耐药菌荧光峰计数显著上升，敏感菌受抑维持基线。该方法有效区分敏感株与多重耐药株的增殖差异（图5）。MIC测定方面，SWIFT-FISH结果与台式微量肉汤稀释法测得的MIC或CLSI推荐范围一致或处于2倍稀释一致性范围内：大肠杆菌-头孢舒啶MIC为64 μg/mL（标准32 μg/mL，2倍范围内）；大肠杆菌-庆大霉素MIC为1 μg/mL（CLSI 0.25–1 μg/mL）；铜绿假单胞菌-庆大霉素MIC为2 μg/mL（CLSI 0.5–2 μg/mL）（图5c-e）。文中以统计学显著性下降（p < 0.05）为判定阈值，实现了免培养条件下的快速药敏表型分析。

图5  SWIFT-FISH快速抗菌药物敏感性测试。

综上，SWIFT-FISH以瞬态热通透替代固定与洗涤,结合微流控连续流单细胞荧光读出与机器学习分类，在同一平台内实现分钟级病原鉴定与小时级表型药敏评估，为缩短感染诊断时间窗和优化精准用药提供新路径。其创新性在于以物理通透加速PNA-FISH并保持无扩增优势，以单细胞峰计数表征增殖从而快速判读耐药，并以多通道比值特征支撑可扩展的多重识别。局限性包括验证的菌种与抗生素组合仍有限，复杂临床基质与低菌量样本对信噪比和模型稳健性的影响需系统评估，混合感染中按菌种分辨的同时AST尚未充分展示，且流程标准化与仪器集成仍待完善。未来应拓展病原与药物覆盖面，发展并行微流控实现多药同测，开展多中心临床验证建立统一阈值与质控，并推进一体化小型化以促进床旁转化。

原文连接：https://doi.org/10.1002/smll.202510292