告别RT步骤！新一代等温扩增技术，实现飞摩尔级病毒检测

新型冠状病毒（COVID-19）、甲型（InfA）和乙型流感病毒（InfB）等呼吸道病毒近年来频繁暴发，对全球公共卫生构成重大挑战。这些病毒感染症状相似，早期精准诊断对于有效治疗和预防传播至关重要。目前，临床核酸诊断的金标准qPCR（实时定量聚合酶链式反应）虽准确，但依赖昂贵设备、专业人员和复杂的样本处理，限制了其广泛应用。

在此背景下，CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）相关诊断技术开始崭露头角。其中，CRISPR-Cas12a系统因其在特异性识别靶标DNA后的反式非特异性切割（trans-cleavage）活性，成为高灵敏度信号放大的理想工具。将CRISPR-Cas12a与等温扩增技术（如RPA）结合的方法（如HOLMES、DETECTOR）展现了优异的灵敏度和特异性。然而，这些方法通常需要分步进行，流程复杂、耗时且存在污染风险。虽然微流控技术可集成两步反应，但仍依赖独立反应室。

更重要的是，Cas12a的反式切割活性可能降解等温扩增所需的模板或引物，降低效率。因此，将扩增与CRISPR检测整合在单一反应管（“一锅法”）仍面临巨大挑战。现有策略（如POIROT）多依赖于逆转录（RT）步骤，延长了反应时间。滚环扩增（RCA）作为一种等温扩增技术，能够直接以RNA为引物进行扩增，无需RT，但传统RCA-CRISPR方法无法直接检测呼吸道病毒等长RNA靶标。因此，亟需开发一种能够整合RCA与CRISPR-Cas12a、无需RT、适用于长RNA靶标的一锅法超快速检测新策略。

研究内容

图1.ACRE的工作原理

通过计算模拟、核酸工程设计和酶动力学分析，将RCA与CRISPR-Cas12a系统无缝整合。系统由工程化设计的辅助DNA（aDNA）、Padlock探针、连接酶、phi29DNA聚合酶和CRISPR-Cas12a核糖核蛋白复合体（RNP）组成。aDNA通过其靶标结合臂和Padlock结合臂，在快速变复性步骤帮助下，与靶标RNA和Padlock探针形成三元复合体。连接酶封闭缺口后，phi29聚合酶启动线性RCA。关键在于，RCA产物可被Cas12a的顺式切割（cis-cleavage）活性识别并切割，产生的短片段可作为新引物再次启动RCA，从而将线性RCA转化为指数级的“RCA循环”。同时，持续的RCA循环不断产生激活Cas12a反式切割活性的产物，实现信号的持续输出与放大，极大提升了灵敏度。

图2.aDNA与Padlock的工程设计

首先设计并筛选了多种aDNA变体，发现全长27nt的双臂aDNA（ADNA-27）信噪比最佳，避免了单臂aDNA可能导致的“Padlock抑制”现象。接着，他们比较了顺式与反式Padlock设计，发现顺式Padlock能更有效地启动RCA循环。通过对aDNA的Padlock结合臂（5-10nt）和靶标结合臂（10-30nt）长度的系统筛选，发现ADNA15+8（靶标臂15nt，Padlock臂8nt）能在避免aDNA-Padlock二聚体形成（导致本底泄漏）的同时，有效形成稳定的三元复合体并触发反应。

图3.ACRE系统的机制研究

对照实验证实，Padlock、T4连接酶和RNP对反应至关重要。值得注意的是，缺乏aDNA的组别也观察到了信号，这可能源于phi29聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性。实验通过使用不同长度的靶标，证实了aDNA在有效触发RCA循环中的关键作用。对反应产物的分析显示，高浓度靶标（>10pM）下，荧光信号反而下降，表明RCA与CRISPR/Cas12a切割之间存在竞争。凝胶电泳证实，RNP的加入能切割RCA产生的高分子量DNA（HMWDNA），并观察到切割产物。

图4.ACRE系统的优化与检测能力

优化确定了最佳条件：T4连接酶15U/μL，phi29聚合酶0.25U/μL，Padlock探针50nM，aDNA100nM，RNP5nM，ssDNA报告分子2μM，BSA0.1mg/mL，dNTPs375μM。此外，优化了变性与退火时间以确保稳定的三聚体杂交。在优化条件下，ACRE对三种呼吸道病毒靶基因（SARS-CoV-2,InfA,InfB）进行了定量检测，在1fM（或10fM）至10pM范围内，荧光信号与靶标浓度对数呈线性关系，计算出的检测限分别低至751aM、3.7fM和863aM。

图5.ACRE对呼吸道病毒临床样本的诊断性能：双盲研究

在针对SARS-CoV-2、InfA和InfB的检测中，ACRE对14个样本（8个阳性，6个阴性）均能正确识别，灵敏度、特异性和准确度均达到100%，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为1.00。定量能力评估显示，ACRE能准确测定临床样本中病毒靶标的浓度，其测定结果与预设浓度高度一致，且荧光强度与病毒浓度相关，证明了其准确定量分析的潜力。

本研究成功开发了一种名为ACRE的超快速、一锅、等温核酸检测新方法，用于呼吸道病毒的长RNA检测。通过对aDNA和Padlock探针的精心工程设计，并将CRISPR-Cas12a系统与RCA创新性整合，ACRE实现了两个关键反应：一是利用Cas12a的顺式切割活性与工程化Padlock，将线性RCA转化为指数级的RCA循环，实现信号的高效扩增；二是揭示了由Padlock、aDNA和phi29聚合酶相互作用形成的“泄漏型切割”机制，这解释了对照组中观察到的微弱本底信号。ACRE无需逆转录步骤和专业仪器，即能在2.5分钟内检测浓度高于10pM的靶标，并对SARS-CoV-2、甲型和乙型流感病毒表现出阿摩尔级的超高灵敏度（751aM,3.7fM,863aM）和单碱基特异性。双盲临床样本验证证实了其100%的诊断准确性。这项工作为开发基于CRISPR的等温扩增技术开辟了新途径，在临床诊断领域具有巨大的应用潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.118141