研究背景

单核苷酸多态性（SNP）是最普遍的基因变异形式，与疾病发生、病毒耐药性、细菌致病性密切相关。甲型流感、新冠病毒等RNA病毒突变率高，快速出现的变异株对公共卫生防控与临床用药构成持续挑战。

当前主流SNP检测依赖RT‑qPCR与高通量测序（NGS），前者需精密温控仪、特异性不足；后者样本需求量大、设备昂贵、分析周期长，难以满足现场快速筛查需求。现有等温扩增技术（LAMP、RPA、CRISPR‑Cas）虽简化温控，但存在探针设计复杂、碱基错配耐受、受PAM位点限制等问题，单核苷酸分辨能力与通用性不足，限制在POCT场景的应用。

为此，研究团队构建LIVE‑SNP技术平台，以高特异性连接为识别核心、快速RPA为放大手段，实现SNP精准可视化检测。

研究内容

LIVE‑SNP 采用两步式核心流程：

1.特异性连接识别：设计两条短链DNA探针，其末端为SNP识别位点，探针间互补区长度控制在10–12 nt，并在倒数第二位引入人工错配以降低非特异连接；仅当靶序列与探针末端完全匹配时，SplintR连接酶（RNA靶标）或T4连接酶（DNA靶标）才催化形成完整连接产物。

2.RPA 等温扩增与荧光输出：连接产物经37–42℃恒温RPA快速扩增，荧光探针被酶切释放信号，通过裸眼观察荧光颜色判定基因型，支持FAM/ROX多色多重检测。

团队系统验证技术性能：

1.检测甲型流感NA与M2基因4种耐药突变（H275Y、I223V、A30T）；

2.检测细菌blaSHV基因3种耐药SNP（M69I、M69V、M69L）；

3.构建集成加热与荧光检测的手持式便携装置，验证模拟临床咽拭子样本的实用性。

图 1. LIVE-SNP 系统原理及检测结果示意图。(A) LIVE-SNP 通过特异性连接和等温扩增反应，对拭子样本进行目视检测，以区分甲型流感病毒突变株。(B) 该检测主要包括两个步骤：用于靶标特异性识别的连接反应和用于信号产生的等温扩增。(C) LIVE-SNP 示意图显示，当存在匹配靶标时，会形成连接产物，并随后通过 RPA 扩增以产生强荧光信号；相比之下，当存在不匹配靶标时，不会产生连接产物或荧光。(D) 在连接反应后，使用一对 PCR 引物扩增连接产物，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析。对比第 6 浓度道（野生型 RNA 输入）与第 7 浓度道（突变型 RNA 输入）表明，只有在存在连接探针、SplintR 连接酶以及完全匹配的 RNA 靶标时，才会发生连接。(E) LIVE-SNP 系统可以实现 IA RNA 的目视检测，其中 IA MT 检测系统可特异性识别突变 IA RNA，仅在存在突变 RNA 时观察到绿色荧光。数据以重复技术测量的平均值 ± 标准差 (SD) 表示。

图2. 流感A病毒常见耐药单核苷酸突变的LIVE-SNP检测。(A) 流感A病毒的四种常见单核苷酸突变类型。I223V和H275Y（2009年流行）为2009年H1N1流感的NA基因突变。H275Y（人类季节性）是季节性H1N1的NA基因突变。A30T是H3N2的M2基因突变。在H275Y（2009年流行）中，C→U的变化导致氨基酸275处的组氨酸→酪氨酸变化。(B) 使用针对四个突变位点的连接探针检测流感A病毒RNA的野生型和突变型。荧光信号实时记录，并在蓝色LED透射仪下观察反应管内的终点荧光。数据以三重复技术测量的均值±标准差表示。

图 3. LIVE-SNP 系统特异性和敏感性验证。(A) LIVE-SNP 的特异性。针对 H275Y（2009 流感大流行）、H275Y（人季节性）和 H3N2 的连接探针分别加入 LIVE-SNP 系统，并对相应的目标 RNA 进行交叉检测。LIVE-SNP 在目标样品与非目标样品之间显示出高信号差异。热图显示三重复测量的平均值。(B) LIVE-SNP 的敏感性。使用来自 10^3 H275Y（2009 流感大流行）突变 RNA，与 10^9 拷贝 H275Y（2009 流感大流行）野生型 RNA 作为阴性对照进行检测。测试时检测限为 10^3 拷贝。为了提高 LIVE-SNP 的敏感性，将连接反应的孵育时间从 30 分钟延长至 1 小时。柱状图表示三重复测量的平均值 ± 标准差（双尾 Student t 检验；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001）。(C,D) H275Y（2009 流感大流行）野生型 RNA 与突变 RNA 的双重检测及端点荧光可视化。LIVE-SNP 混合液包含两套针对野生型 RNA 和突变 RNA 的连接探针和两套荧光探针。每对探针与其对应的目标 RNA 杂交，允许发生连接和 RPA 反应，并发出可区分的荧光。通过非重叠荧光的强度来确定每种目标 RNA（10^8 拷贝）的存在。热图显示三重复测量的平均值。

研究结果

1.单碱基精准区分：连接反应仅在完全匹配时发生，错配靶标无有效连接与荧光，野生型与突变型信号差异显著，无交叉干扰。

2.高灵敏度：检测限达10³拷贝靶RNA，延长连接时间可进一步提升灵敏度。

3.多重并行检测：单管内同时识别野生型与突变型，FAM绿荧光示野生型、ROX红荧光示突变型，混合模板呈现黄荧光，实现一管多判。

4.跨核酸类型适用：兼容RNA（流感病毒）与DNA（细菌耐药基因），更换连接酶与缓冲盐即可适配不同靶标。

5.模拟临床样本有效：在加标人咽拭子样本中准确区分流感野生型与4种突变株，荧光信号差异具有统计学意义。

6.便携式装置验证：自制手持设备完成恒温扩增与荧光观测，结果与仪器检测一致，支持现场即时判读。

图4. 使用LIVE-SNP系统对甲型流感病毒样本的可视化检测。(A) 使用慢病毒载体系统产生A30T、H275Y（2009年流感大流行株）、I223V和H275Y（人类季节性株），通过293T细胞转染，48小时和72小时后收获，并加入健康人鼻咽拭子样本中，以模拟临床甲型流感样本。在简单核酸提取后，对加标样本进行可视化检测。(B) 使用已建立的方法检测样本，并在qPCR仪器上收集终点荧光信号，同时在蓝色LED透射仪下观察反应管中的荧光。柱状图表示三次测量的均值±标准差（双尾学生t检验；非配对；***P < 0.001；****P < 0.0001）。

图5. 使用LIVE-SNP系统检测细菌DNA中的耐药性单核苷酸突变。(A) 使用针对三种耐药性单核苷酸突变（M69I、M69V和M69L）的连接探针检测野生型和突变型DNA序列，荧光信号实时记录，并在LED透射光灯下观察终点荧光。检测的DNA模板为10^7拷贝。数据以三次重复测量的平均值±标准差表示。(B) 评估LIVE-SNP针对SHV突变亚型（M69I、M69V、M69L）的特异性。分别将针对M69I、M69V和M69L的连接探针加入到LIVE-SNP系统中，并交叉检测对应的目标DNA。热图显示三次技术测量的平均值。

图6. 可用于现场点突变检测的便携式设备。(A) 手持设备的结构。便携式设备电路板的设计。(B) 便携式设备的光学设计。(C) 集成了LIVE-SNP的便携式设备用于检测甲型流感病毒的代表性测试结果。

技术优势

1.探针设计极简：仅需靶序列即可开发，不受突变碱基类型限制，通用性强，可快速适配新发变异株。

2.特异性突出：以连接酶的碱基专一性实现单核苷酸分辨，克服RPA错配耐受缺陷，背景信号极低。

3.全程等温快速：无需变温循环，39℃左右完成扩增，2 小时内出结果，适合现场快检。

4.结果直观可视化：裸眼判读荧光颜色，无需专业软件与复杂分析，非专业人员可操作。

5.设备低成本便携：加热模块与荧光观测模块集成，体积小巧、供电简便，大幅降低硬件门槛。

6.应用场景广泛：覆盖病毒变异、细菌耐药、基因分型、食品安全与感染病防控等场景。

结论与展望

本研究成功建立LIVE‑SNP检测体系，突破传统 SNP 方法依赖贵重仪器、操作繁琐、特异性不足的瓶颈，实现单碱基突变高灵敏、高特异、可视化、便携式快速检测，在RNA与DNA靶标上均表现稳定可靠，为资源受限环境下的病原耐药监测与即时诊断提供全新方案。

该技术目前无法识别未知突变，需与高通量测序联用，先锁定关键突变位点再设计探针开展大规模筛查。未来可进一步优化探针与酶体系，提升检测速度与多重通量；推进手持式设备小型化与智能化，拓展在机场、口岸、社区诊所等场景的应用，为新发传染病快速响应与精准用药提供硬核支撑。

原文链接：10.1021/acs.analchem.5c06616