片球菌是革兰氏阳性、兼性厌氧的同型发酵球菌，广泛存在于动植物、发酵酒类、肉制品、乳制品及果蔬发酵制品中，是发酵食品工业中的核心功能微生物之一。同时，部分片球菌也会引发葡萄酒、啤酒等产品腐败变质，造成经济损失。传统片球菌检测以生化鉴定为主，存在操作繁琐、成本高、耗时长等缺陷；常规核酸检测技术则需对靶标基因进行大量前期研究，且难以实现单核苷酸多态性（SNP）的精准区分，检测灵敏度与特异性难以兼顾。

针对上述难题，研究团队以片球菌 16S rRNA 基因的特异性 SNP 位点为靶标，创新性融合ARMS-PCR（扩增阻滞突变系统） 与CRISPR/Cas12a两大技术，构建了 “双重识别” 的快速检测体系。该系统先通过 ARMS-PCR 对靶标序列进行特异性扩增，再利用 CRISPR/Cas12a 的反式切割活性激活荧光信号，实现对片球菌的精准识别。团队通过序列比对，筛选出片球菌属特异性 SNP 位点，并优化引物与 crRNA 设计，在等位基因特异性引物 3' 端引入人工错配，大幅提升 SNP 检测分辨率。

图 1：片球菌快速检测技术原理与操作流程示意图

实验结果显示，该检测系统展现出卓越的检测性能。在灵敏度方面，对片球菌基因组 DNA 的检测限低至8.15×10⁻⁵ ng/μL，较传统琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度提升约 1000 倍；在加标食品样品中，检测限可达6.9 CFU/mL，满足食品中微量致病菌与功能菌的检测需求。在特异性测试中，该系统能精准区分片球菌与类肠球菌、芽孢杆菌、乳酸菌、大肠杆菌等 11 种常见细菌，无交叉反应，特异性表现突出。

图 2：所建检测方法对目标菌株的特异性识别结果

更具应用价值的是，该技术高效便捷、成本低廉。整套检测流程仅需1.5 小时，远快于传统 PCR 方法（2.5-4 小时），无需大型精密仪器，仅需荧光酶标仪即可完成检测，适配食品生产现场的快速监测需求。同时，技术仅需探针、DNA 聚合酶与 CRISPR/Cas12a 试剂，大幅降低检测成本，适合基层实验室与食品企业推广使用。

图 3：实际食品样品中片球菌的检测效果验证结果

为验证实际应用效果，研究团队对 12 份市售发酵果蔬样品（泡菜、酸豆角、酸笋、黄瓜）进行检测，成功精准检出 3 份片球菌阳性样品，检测结果与实时荧光定量 PCR（qPCR）完全一致，证实该技术在复杂食品基质中仍保持稳定可靠的检测性能。

此次研发的 ARMS-CRISPR/Cas12a 检测技术，突破了传统微生物检测 “慢、繁、贵” 的瓶颈，兼具高灵敏、高特异、快速、低成本等多重优势，不仅填补了片球菌快速精准检测的技术空白，也为其他食品微生物的核酸检测提供了可复制的技术范式。该成果可直接应用于发酵食品生产过程质控、食品腐败菌监测、肠道微生物研究等场景，对提升食品质量安全管控水平、推动发酵食品产业智能化升级具有重要的理论价值与实用意义。

随着食品工业对微生物检测效率与精度要求的不断提升，这种基于 CRISPR 技术的新型核酸检测方法，将成为微生物快速筛查的主流技术之一，为食品安全监管、功能微生物开发提供强有力的科技支撑。

参考文献：Li X, Lu H, Li S, et al. Rapid and Simple Detection of Pediococcus Using ARMS-CRISPR/Cas12a Method[J]. Talanta, 2026: 129806.