单核苷酸多态性（SNPs）是生物体中最常见的遗传变异形式，与疾病发生、微生物耐药性和致病性等密切相关。以甲型流感、SARS-CoV-2为代表的病毒突变率极高，导致新变异株不断出现，严重威胁公共卫生安全，因此迫切需要能够有效区分新兴变异的多功能诊断工具。然而，目前临床SNP检测方法（如下一代测序、定量PCR等）通常依赖复杂的引物/探针设计、精密仪器和专业的生物信息学分析，限制了其在资源有限环境下的广泛应用。

等温扩增技术（如LAMP、RPA）因无需热循环仪，在快速现场检测中展现出潜力。但现有等温技术（包括CRISPR-Cas系统）在精准识别SNP方面存在局限性：LAMP-OSD探针设计复杂；RPA中重组酶对错配的耐受性会降低其区分SNP的能力；CRISPR-Cas方法受限于PAM位点，且鉴别位点的设计需经验摸索。因此，现有技术尚未能充分发挥其在现场精确识别SNP方面的潜力。

连接反应因其在互补靶序列存在时，连接酶可特异性催化相邻探针连接的特性，在分子诊断中已被用于基因突变检测，并展现出高特异性。本研究旨在将连接反应的高特异性与RPA的快速等温扩增能力相结合，开发一种操作简单、结果可视、适用于现场快速检测SNP的新平台，以应对传染病防控、耐药性监测等领域的迫切需求。

研究内容

图1.LIVE-SNP的原理

第一步是特异性连接反应：两条单链DNA连接探针（探针A和B）在靶标存在时，特异性杂交至相邻位置。探针A的5‘端磷酸化，其末端碱基设计为SNP识别位点，并在倒数第二位引入人工错配碱基以增强特异性。当末端碱基与靶标完全匹配时，SplintR连接酶会催化两者连接，形成一条完整的单链DNA产物；若存在错配，则连接无法发生。第二步是信号放大与读出：连接产物作为RPA的模板，被快速等温扩增。RPA反应体系中的荧光探针（含THF位点）在ExoIII酶作用下被切割，产生荧光信号。通过使用不同荧光标记的检测探针，可实现多重检测。 

图2.通过LIVE-SNP系统可视化检测甲型流感耐药性SNPs

针对每个突变位点的野生型和突变型RNA，分别设计了特异性连接探针。实验结果表明，只有在探针与靶标完全匹配时，才能产生强烈的荧光信号，而错配靶标（如突变型探针对野生型靶标）的信号与空白对照相近。通过肉眼观察反应管在蓝色LED下的终点荧光，可以清晰地区分野生型与突变型样本。

图3.LIVE-SNP系统的分析性能

交叉反应性测试表明，针对不同流感亚型（2009年大流行H1N1、季节性H1N1、H3N2）设计的LIVE-SNP探针仅对其对应的靶标RNA产生响应，无交叉反应，显示出高特异性。灵敏度测试显示，该方法可检测低至1000拷贝的靶标RNA。更重要的是，研究者通过巧妙设计，将识别野生型和突变型靶标的连接探针分别与FAM（绿）和ROX（红）标记的荧光检测探针配对，整合到同一反应体系中，实现了单管双重检测。

图4.实际样本的检测

直接使用未纯化的热裂解样本会因基质抑制效应而影响信号，因此采用磁珠法纯化核酸。使用LIVE-SNP检测纯化后的样本，能够准确区分野生型病毒与四种突变型病毒样本，终点荧光信号存在显著统计学差异，且肉眼观察结果清晰可辨。

图5.LIVE-SNP用于病原体检测的广泛适应性

以临床重要的β-内酰胺酶耐药基因blaSHV的M69位点突变（M69I,M69V,M69L）为例，建立了DNASNP检测方法。由于检测对象为DNA，连接反应改用T4DNA连接酶并在高盐条件下进行以优化性能。实验结果表明，LIVE-SNP系统同样能有效区分这三种仅有一个核苷酸差异的DNA点突变，并表现出高特异性。

本研究成功建立了一种名为LIVE-SNP的快速、可视化单核苷酸多态性检测平台。该平台的核心在于将连接酶介导的高特异性序列鉴别与重组酶聚合酶扩增的高效信号放大相结合。通过对连接探针的工程化设计（末端SNP识别位点+人工错配），系统实现了对单碱基差异的高精度区分。LIVE-SNP兼具高灵敏度（可检测1000拷贝靶标）、高特异性、及多重检测能力，并能同时适用于RNA（如流感病毒）和DNA（如细菌耐药基因）靶标。研究进一步开发了集成加热与荧光检测模块的便携式手持设备，使检测结果可通过肉眼直接判读，实现了从样本到答案的现场快速分析。凭借其简单、快速、直观和成本效益高的特点，LIVE-SNP为传染病防控、耐药性监测及现场基因分型提供了一个极具潜力的强大技术平台。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5c06616