耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）可引起从皮肤感染到脓毒症、肺炎等多种严重疾病，还可能沿食品生产链传播，既威胁临床治疗，也影响食品安全。由于其对β-内酰胺类抗生素具有耐药性，相关感染往往伴随更高死亡风险，因此建立快速、准确的检测方法具有明确的现实必要性。现有qPCR、dPCR和NGS虽然能够用于耐药基因识别，但普遍依赖专业实验室、复杂流程或昂贵设备，难以满足基层医疗和现场快速筛查的需求。CRISPR/Cas技术为病原核酸检测提供了新的路径，结合等温扩增还能进一步提升检测能力，但传统FRET探针读出仍存在背景高、淬灭干扰等问题，限制了结果的简便可视化。基于此，本研究尝试将被切割后的荧光探针富集到固相表面，通过磁珠实现信号浓缩与增强，从而将原本分散且不易直接观察的荧光读出转化为更直观的可视化信号。如图1所示，Cas12a/crRNA复合物在识别并结合目标DNA后，会激活对BC-Q单链DNA探针的转切割活性。该探针同时携带Cy5荧光基团、生物素及淬灭基团，被切割后可与链霉亲和素包被的磁珠结合，形成可在荧光显微镜下清晰观测的磁珠-荧光偶联信号；而在无靶标条件下，探针不发生切割，荧光仍处于淬灭状态，磁珠表面基本不产生可检测信号。由此，该策略不仅提高了信号强度和信噪比，也为MRSA的定性识别与定量分析提供了更简便的读出方式。

图1  基于CRISPR-on-beads的MRSA检测原理示意图。

作者首先展示了基于LbCas12a的CRISPR-on-beads检测体系对合成靶DNA的识别能力。图2表明，在不同合成靶DNA浓度条件下，磁珠表面的荧光信号随目标浓度增加而增强，同时在磁珠结合前的溶液相读数也与显微成像结果一致，说明该体系本身具备稳定的浓度响应，并可实现0.09 ng/μL的合成靶DNA检测。进一步，为进一步提高对实际菌样的检测能力，作者引入RPA进行等温扩增与CRISPR/LbCas12a联合，将对MRSA的检测限提高至3×10⁴ CFU/mL，相较于不经RPA的直接检测，灵敏度至少提高了4个数量级（图3）。在这里，还展示了磁珠富集后的显微读出与溶液相读出具有一致性，但磁珠能够将分散荧光集中为清晰亮点，从而提升信噪比，并降低对大型读出设备的依赖。此外，作者还将MRSA、普通金黄色葡萄球菌以及3株大肠杆菌进行比较，结果仅MRSA样本出现阳性荧光信号，其余菌株均未检测到明显信号，验证了方法的特异性（图4）

图2  基于CRISPR-on-beads的合成靶DNA检测限评估。

图3  基于RPA-CRISPR-on-beads的MRSA检测限评估。

图4  基于CRISPR-on-beads策略的MRSA检测特异性验证。

综上，本研究创新性地将Cas12a切割后的荧光探针富集到磁珠表面，提出了基于固相信号浓缩的MRSA可视化检测策略，其主要创新在于信号读出方式的改进。需要指出的是，该方法当前检测限为3×10⁴ CFU/mL，灵敏度仍明显低于qPCR，实际应用价值受到一定限制；同时，其终端读出仍依赖荧光显微镜，并未实现真正意义上的无仪器检测。因此，这项工作更适合作为一种可视化检测思路的验证，而非成熟的现场检测方案。未来应优先提升扩增与信号放大效率，进一步降低检测限，并探索更低门槛的便携式读出方式。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snr.2025.100418