DNA纳米机器出击，30分钟“照亮”食品中的细菌

全球新鲜农产品供应链规模庞大、周转迅速，对微生物安全构成了持续挑战，其中金黄色葡萄球菌因其普遍存在且可导致速发型葡萄球菌食物中毒，成为重大威胁。即食食品（如绿叶蔬菜）极易受到污染，迫切需要在产品短保质期内、无需复杂实验室设备即可得出结果的现场检测技术。

当前的检测范式在准确性、速度与现场部署能力之间存在关键矛盾。金标准的培养法灵敏度高但耗时过长（24-72小时），完全不适用于新鲜农产品的快速决策。核酸扩增技术（如PCR）虽快速、特异，但仍依赖昂贵的热循环仪和专业操作人员，无法用于现场筛查。近年来发展的等温扩增技术（如LAMP、RPA）虽无需热循环仪，但易受复杂食品基质中抑制物的干扰，且易因气溶胶污染产生假阳性。CRISPR诊断系统灵敏度高，但面临Cas蛋白成本高、化学性质不稳定、需冷链运输等实际限制。电化学生物传感器虽有微型化潜力，但电极易受食品样本中蛋白质和颗粒污染，影响信号可靠性。

因此，亟需一种能整合实验室级灵敏度与特异性，且足够简单、适用于食品生产环境现场操作的新平台。基于G-四链体/血红素的DNA纳米机器因其可编程性、操作稳健性及无需复杂仪器即可放大信号的特性，成为有前景的解决方案。本研究的核心挑战是将此分子技术与一个能处理原始样本、为操作员提供明确结果的封闭式、自动化系统相集成。

研究内容

图1.过氧化物酶样DNA纳米机器的设计

与传统的二元G-四链体相比，本研究采用了三探针（支架探针、F-探针、M-探针）设计，以显著提高无靶标时的自组装热力学壁垒，从而有效降低背景噪声。其核心机制是：靶标金黄色葡萄球菌核酸作为模板，引导三个探针同时杂交，从而重新组装出富含鸟嘌呤的序列，该序列折叠形成稳定的G-四链体结构。随后加入的血红素与该G-四链体结合，形成具有催化活性的G-四链体/血红素DNA酶复合物。该复合物模拟过氧化物酶活性，在过氧化氢存在下催化鲁米诺氧化，发射光子。化学发光信号的强度与靶标浓度成正比。

图2.G-四链体/血红素复合物化学发光强度的优化

通过共优化鲁米诺、过氧化氢浓度和缓冲液pH，确定在pH 8.5、100 μM鲁米诺和10 μM过氧化氢条件下可获得最佳信噪比。此时，碱性条件有利于鲁米诺反应性单阴离子形式存在，但过高的pH（9.0）会因非催化背景发光增强而降低信噪比。进一步优化表明，1 μM血红素（与1 μM G-四链体形成近似1:1复合物）可提供最大信噪比，过高或过低的血红素浓度会因自聚集或催化位点未饱和而降低性能。

图3.PxDm设计的优化

针对金黄色葡萄球菌ATP依赖性核酸酶亚基基因的111核苷酸靶标序列，设计了两种PxDm构建体。构建体2在F-探针识别模块中故意引入了一个单核苷酸替换，旨在破坏M-探针与F-探针之间一个4核苷酸互补区可能导致的非特异性杂交。实验证实，构建体2的信噪比显著高于完全互补的构建体1，这主要归功于其背景信号降低约两倍。因此，选择构建体2进行后续研究。

图4.金黄色葡萄球菌atp依赖核酸酶亚基A基因（分析物）单链(A)和双链(B)靶序列的检测。

在优化条件下，PxDm对合成单链DNA靶标（对应S. aureus基因片段）进行了检测。结果显示，在室温下5分钟孵育后，化学发光信号与靶标浓度（0-250 nM）相关，计算得出的检测限为9.7 nM。特异性通过还原因子量化，对于单核苷酸替换变体（G→A, G→T, 双替换）和非靶标（E. coli gyrA基因片段），RF值分别高达98%、93%、98%和99.8%，显示出极高的特异性。温度稳定性测试（17-27°C）表明，温度变化对检测性能和特异性无显著影响。试剂稳定性评估显示，试剂在室温下可稳定使用3小时，在4°C下可稳定24小时。

图5.PxDm检测DAMP放大器

为提升实际样本检测灵敏度，将PxDm与上游的双引物等温扩增技术集成。DAMP因其单温（60℃）、快速且对抑制剂耐受性较好而被选中。集成后的DAMP-PxDm系统对系列稀释的S. aureus基因组DNA进行检测，在0-700基因组当量范围内信号呈线性相关，检测限为227 GE。在104 GE以上观察到信号下降，符合报道的“高剂量效应”。特异性测试显示，系统能有效区分含有单核苷酸错配的模拟靶标扩增子和非靶标E. coli扩增子，RF值分别为64%和62%。

图6.真实样品中金黄色葡萄球菌PxDm的检测

最后，在生菜和菠菜叶片接种的实际样本中验证了系统的性能。样本处理包括细菌回收、DNA提取、DAMP扩增和PxDm检测。系统成功在仅含S. aureus的样本以及S. aureus与E. coli共存的混合样本中检测出目标扩增子，且信号强度在纯S. aureus样本与混合样本间差异很小（生菜中仅差4%），表明非靶标DNA的存在对检测干扰很小。计算的选择性（RF值）在生菜和菠菜基质中均接近或达到100%，证实了方法在实际复杂食品基质中具有极高的特异性。

本研究成功设计并验证了一种基于靶标模板化G-四链体组装的过氧化物酶样DNA纳米机器平台，用于在紧凑的密闭比色皿设备中通过化学发光高灵敏度、高选择性地检测核酸。经系统优化，该平台对单链DNA靶标达到了9.7 nM的低纳摩尔级检测限，并能以高达98%的信号还原率区分单核苷酸替换，其化学发光读出模式在灵敏度和特异性上均显著优于传统的比色法和荧光法。通过适配双链DNA检测并与双引物等温扩增技术集成，构建的DAMP-PxDm系统实现了227基因组当量的临床相关灵敏度，并在生菜、菠菜等复杂食品基质中准确检测出金黄色葡萄球菌，即使存在非靶标细菌（如大肠杆菌）干扰也表现稳健。该平台将灵敏度、特异性和操作简易性（总检测时间仅数分钟）有力结合，为分子诊断、食品安全和环境监测等需要快速出结果的现场应用提供了极具前景的工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118408