1.        引言

循环肿瘤DNA（ctDNA）作为液体活检的关键标志物，能直接反映肿瘤特异性基因突变，在癌症早期诊断和预后监测中具有重要价值。然而，ctDNA在体液中含量极低、半衰期短且存在肿瘤异质性，传统检测方法如数字PCR和二代测序虽有一定灵敏度，但存在操作复杂、耗时长、成本高且易产生扩增错配等局限，难以满足快速精准的临床需求。因此，开发一种超高灵敏度、高特异性且操作简便的ctDNA检测新策略，对于推动早期癌症诊断和治疗监测具有重要意义。

本研究创新性构建基于级联激活DNA纳米门控（CANDG）与磷掺杂铁单原子电催化剂（P/Fe-SAN）的双模生物传感器，以ctDNA-PIK3CA为标志物，实现循环肿瘤DNA的zeptomolar级超高灵敏检测。通过优化DNA链置换反应、Exo III酶辅助放大及P/Fe-SAN催化体系，确定最优检测条件，有效排除单碱基错配与非特异性序列干扰。经标准品、血清及肿瘤细胞裂解液验证，实现电化学模式检出限63.8 zM、比色模式检出限111.2 aM，单次检测约120分钟，无需PCR扩增，突破传统方法操作复杂、灵敏度不足与假阳性缺陷，为早期癌症液体活检与精准诊断提供高效灵敏新方案。

2.        研究内容：

传感器的基本工作原理：靶标ctDNA触发级联链置换反应，释放O1并循环扩增；O1与HP杂交后，Exo III酶切降解HP，打开MOF纳米门控，释放内部TMB。P/Fe-SAN催化TMB氧化，产生电化学（DPV）和比色（UV-vis）双模信号，实现高灵敏检测。

方案 1. P/Fe-SAN-CANDG 系统工作原理示意图。(A) HP@TMB@MOF 纳米探针的制备。(B) 结构抑制子 S 介导的靶标触发变构激活和级联链置换。(C^---D) P/Fe-SAN-DNA 纳米开关双模式生物传感平台的构建。

 P/Fe-SAN和P/Fe-SAN/CFP传感电极的表征：SEM显示CFP为交织三维碳纤维网络，负载P/Fe-SAN后附着多孔石墨碳。HRTEM和HAADF-TEM确认Fe呈单原子分散。EDS、XRD、XPS证实C、N、P、Fe共存，无Fe纳米颗粒；XPS显示Fe-N和Fe-P配位，成功合成单原子催化剂。

图 1. (A) P/Fe-SAN 制备方案；(B) CFP 的 SEM 图像；(C)P/Fe-SAN 的 SEM 图像；(D-E)P/Fe-SAN 的 TEM 图像；(F)P/Fe-SAN 的 HAADF-TEM 图像。(G-K)P/Fe-SAN 的 EDS 元素分布图。

图 2. (A) P/Fe-SAN 的 XRD 光谱；(B) P/Fe-SAN 的全 XPS 光谱及 Fe 2p (C), N 1 s (D)和 P 2p (E)的高分辨率 XPS 光谱；Fe 箔、Fe₂O₃、FeO、酞菁铁(FePc)和 P/Fe-SAN 的 Fe K-edge XANES 光谱(F)及加权傅里叶变换 EXAFS 光谱(G)；(H) P/Fe-SAN 的 EXAFS k 空间中拟合曲线与实验曲线；(I) P/Fe-SAN 的 EXAFS R 空间中拟合曲线；(J) 与 Fe 箔、FeO 和 FePc 相比的 P/Fe-SAN 加权小波变换 Fe K-edge EXAFS 光谱。

P/Fe-SAN的催化活性分析：P/Fe-SAN具有类氧化酶活性，可直接催化O₂氧化TMB生成蓝色产物。稳态动力学显示Km=0.0057 mM、Vmax=6.033×10⁻⁶ M s⁻¹，优于Fe-N₄。ESR证实产生超氧自由基。电催化测试表明，P/Fe-SAN/CFP对TMB的电流响应比裸CFP高13.56倍。

图 3. (A) TMB (a), P/Fe-SAN (b), Fe-N₄ + TMB (c) 和 P/Fe-SAN + TMB (d) 的紫外-可见光谱。初始反应速率与后续试剂浓度的关系： (B) P/Fe-SAN 和 (D) Fe-N₄。初始反应活性与底物构象的 B 逆关系： (C) P/Fe-SAN 和 (E) Fe-N₄； (F) O ₂ ^•− 的 ESR 光谱。(G) 空白 CFP 和 P/Fe-SAN/CFP 在含 2 μM TMB 的 PBS 溶液中的 DPV 响应曲线。(H) DPV 电流响应的比较。

 P/Fe-SAN电催化剂的DFT理论计算：DFT计算表明，P掺杂优化Fe-N₄电子结构，降低O₂吸附能（-4.35 eV）和OOH→H₂O反应能垒，提升催化活性。差分电荷密度显示电子在Fe中心富集；PDOS分析证实Fe 3d与N/P p轨道重叠增强，促进O₂活化与电子转移。

图 4. (A) P/Fe-SAN 活性位点（*表示 P/Fe-SAN 活性位点）上 O₂还原为 H₂O 的反应路径。(B) P/Fe-SAN 上 O₂吸附位点的差分电荷分布，黄色/蓝色区域表示电子富集/耗尽。(C) P/Fe-SAN 催化模型表面 O₂催化路径的能量曲线（类似 OXD 活性）。(D, E) Fe-N₄和 P/Fe-SAN 模型的局部态密度（PDOS）分析。

UiO-66-NH₂纳米材料的表征：SEM显示UiO-66-NH₂呈均匀规则八面体，粒径约700 nm。EDS证实含C、N、O、Zr元素。FT-IR谱图中出现N-H（1257 cm⁻¹）、C-N（1658 cm⁻¹）及-NH₂特征峰（3477/3343 cm⁻¹），确认材料成功合成。

图 5. UiO-66-NH 2 的 SEM 图像（A 至 D）和 EDS 能谱（E 至 H）

P/Fe-SAN的电化学行为：CV显示P/Fe-SAN/CFP电流较裸CFP提高3.52倍，EIS表明电荷转移电阻显著降低。ECSA为裸CFP的3.45倍。不同扫速CV表明反应受扩散控制，电荷转移系数α=0.4932，表观电子转移速率常数K_s=2.87 s⁻¹，导电性优异。

图 6. (A) CV 曲线和(B) EIS 曲线用于评估裸 CFP 和 P/Fe-SAN/CFP 的电子转移能力（电导率）。(C) 不同修饰的 CFP 传感电极在 50 mV/s 下的 CV 测试曲线，用于估算 ECSA。(D) 不同修饰的 CFP 传感电极的电化学有效活性面积比较。(E) P/Fe-SAN/CFP 在不同扫描速率下的 CV 曲线。(F) P/Fe-SAN/CFP 电极的峰电流与扫描速率平方根（v ^1/2 ）的线性校准图。(G) P/Fe-SAN/CFP 电极的扫描速率对数（lgv）与氧化还原电位的线性校准图。

HP@TMB@MOF的制备与稳定性验证：Zeta电位从+33.93 mV（UiO-66-NH₂）变为+41.93 mV（包封TMB）再降至-30.33 mV（修饰HP），证实成功制备。释放实验显示，HP密封后300 min内TMB释放率仅3.2%（无HP时63.4%），在PBS中孵育300 min信号稳定，证明HP具有良好门控锁止效果。

图 7. (A) 在制备(a) UiO-66-NH ₂ 、(b) HP@MOF、(c) HP@TMB@MOF 过程中不同样品的 zeta 电位值。(B) TMB@MOF 和 HP@TMB@MOF 中 TMB 的释放速率。(C) HP@TMB@MOF 在 PBS 缓冲液中的不同孵育时间稳定性分析。(D) ctDNA 触发的双输出脚手架介导的链置换反应和酶触发的酶切反应的 PAGE 电泳图谱。(M) 25 bp DNA Marker、(1) S0、(2) O1、(3)靶 ctDNA、(4) F1、(5) HP、(6) S0 + O1、(7) S0 + O1 + 靶 ctDNA+F1、(8) S0 + O1 + 靶 ctDNA+F1 + HP、(9) S0 + O1 + 靶 ctDNA+F1 + HP + Exo III。(E) 在靶标存在与否情况下均相传感器的 DPV 响应曲线。(F) 在靶标存在与否情况下比色传感模式的光吸收响应曲线。

所提出的双模式生物传感器用于线性检测：电化学模式下，DPV电流与ctDNA浓度在1 aM~100 nM间线性相关（R²=0.9973），LOD=63.8 zM；比色模式下，吸光度在1 fM~100 nM间线性相关（R²=0.9954），LOD=111.2 aM。检测全程约120 min，灵敏度优于多数报道方法。

图 8. 通过两种模式检测 ctDNA。在电化学模式下，DPV 电流 (A) 和 ΔDPV 电流响应与线性校准曲线 (B) 对 ctDNA 浓度 (0, 1 aM, 10 aM, 1 fM, 100 fM, 10 pM, 1 nM 和 100 nM)。在比色模式下，吸光度 (C) 和 Δ吸光度响应与线性校准曲线 (D) 对 ctDNA 浓度 (0, 1 fM, 10 fM, 100 fM, 10 pM, 1 nM 和 100 nM)。在电化学模式下，研究了生物传感器的重现性 (E)、对 ctDNA 的选择性 (F)（在存在各种干扰物质（Mix、ctDNA-SM、ctDNA-TM 和 ctDNA-NC）时）以及九天稳定性评价 (G)。在比色模式下，在相同干扰条件下评估了生物传感器的重现性 (H)、选择性 (I) 和九天稳定性评价 (J) (n = 3)。面板 (K) 和 (L) 分别显示了电化学和比色模式下从 MCF-7、A549 和 EC 细胞中提取的基因的检测和分析。

实际样品分析：血清加标回收率：电化学92.2%~108.7%，比色97.9%~110.0%，RSD<4.08%。肿瘤细胞裂解液中，MCF-7细胞（含PIK3CA突变）信号显著高于A549和EC细胞。临床血样（5健康+10乳腺癌）检测显示患者信号显著升高，与qRT-PCR结果一致，验证了临床可行性。

图 9. 健康对照组（HCs）和乳腺癌患者（BCPs）血液样本中 ctDNA-PIK ₃ CA 检测的电化学峰电流（A）、比色吸光度（B）以及 qRT-PCR 结果的箱线图分析（C）。ctDNA-PIK ₃ CA 检测在血液样本中的电化学峰电流和比色吸光度的分布分别用柱状图（D-E）和热图（F-G）展示。

3.        结论：

本研究成功构建一种基于级联激活DNA纳米门控（CANDG）与磷掺杂铁单原子电催化剂（P/Fe-SAN）的双模生物传感器，可实现循环肿瘤DNA（ctDNA）的zeptomolar级超灵敏检测。该传感器以ctDNA-PIK3CA为靶标，通过靶标触发的链置换级联反应与Exo III辅助的门控释放，结合P/Fe-SAN对TMB的高效催化，实现电化学与比色双信号输出。优化后电化学检测限低至63.8 zM，比色检测限为111.2 aM，单次检测约120分钟，无需PCR扩增。血清加标回收率92.2%~110.0%，并能有效区分MCF-7、A549及EC细胞中的目标序列，临床血样验证与qRT-PCR结果一致。该传感技术特异性强、稳定性好、抗干扰能力优异，为早期乳腺癌等癌症的液体活检及精准诊断提供了高灵敏、高可靠的新型检测手段。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.175784