MicroRNA是基因表达的关键调控因子，其异常表达与多种恶性肿瘤密切相关，是极具潜力的疾病诊断生物标志物。然而，传统的miRNA检测方法（如微阵列、Northern印迹、qRT-PCR）通常依赖复杂仪器和专业操作，限制了其广泛应用。酶介导的等温扩增（如RPA、LAMP）可显著提高灵敏度，其中体外转录放大因其可编程的转录开关而成为强大策略。尽管空间限制和靶标富集策略（如球形DNA纳米结构）可加速反应，但它们通常需要外源引入Cas12a激活剂，增加了系统复杂性。

因此，开发一种基于Cas12a、兼具快速动力学和操作简便性的新方法仍面临挑战。本研究旨在整合磁珠富集、催化发夹组装和转录放大，构建一个高效、低背景、无需外源激活剂的级联放大检测平台，以突破现有CRISPR检测技术在灵敏度、通用性和实用性方面的瓶颈。

研究内容

图1.MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a系统的工作原理

第一模块为靶标识别与模板组装：目标miRNA-21与固定在磁珠上的发夹H1结合，触发CHA反应，使三个初始锁定的发夹（H1,H2,H3）动态组装成一个完整的T7转录模板。第二模块为转录放大与Cas12a激活：T7RNA聚合酶识别该模板，转录出大量的支架RNA。该支架RNA与转录模板自身的粘性末端杂交，自组装形成功能性的crRNA，从而激活Cas12a的反式切割活性，产生荧光信号。Cas12a的切割还能释放被报告分子结合的支架RNA，使其参与进一步的扩增循环，形成额外放大。

图2.CHA@TA-CRISPR/Cas12a系统的设计与可行性

首先，通过PAGE系统优化了发夹H1的茎干长度（14bp）、H3的趾端长度（7nt）以及H1与H3间的互补碱基数，以平衡催化效率与背景信号。NUPACK模拟显示，只有在目标miRNA存在时，H1/H2/H3三元复合物（转录模板）才能高效形成，而对照组无明显交叉杂交，验证了CHA路径的可行性。PAGE实验进一步证实了从miRNA/H1复合物到最终转录模板的逐步组装过程，且系统对其他miRNA具有高特异性。

图3.磁珠表征与检测信号

通过紫外光谱、动态光散射和Zeta电位分析，证实了发夹H1成功偶联到磁珠上。动力学对比显示，基于磁珠的系统在40分钟内的荧光信号强度显著高于均相系统，其催化效率（Kcat/Km）提升了三个数量级，证明磁珠通过提高局部浓度有效加速了反应。组分缺失实验表明，转录模块和Cas12a对于信号产生至关重要。再次用DNaseI处理实验证实，转录模板是激活CRISPR/Cas12a级联所必需的激活剂。

图4.对miRNA-21的检测性能

在100aM至10nM范围内，荧光信号与靶标浓度正相关，在100aM至1pM区间内呈现良好线性，检测限低至65.3aM。与无磁珠的均相检测相比，灵敏度提升了约3个数量级。传感器对let-7a、miR-149等其他miRNA及单碱基突变体响应微弱，显示出高特异性。

图5.MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a系统的临床验证

首先检测了多种细胞系（HepG2,HeLa,MCF-7癌细胞vs.MCF-10A正常细胞）中的miRNA-21表达水平，结果显示癌细胞中miRNA-21表达显著上调，与RT-qPCR结果趋势一致，验证了方法的准确性。随后，对10例乳腺癌患者和6例健康对照的血清样本进行分析，该方法成功区分两组样本，检测结果与RT-qPCR具有良好一致性。初步的侧向流试纸条检测也显示患者与健康人之间存在清晰的信号差异，展示了其临床转化潜力。

本研究成功构建了一种基于磁珠富集-催化发夹组装-模板激活CRISPR/Cas12a的级联放大生物传感器，用于超灵敏检测miRNA。该设计的创新性在于：1）通过CHA反应原位组装分裂的T7启动子模板，有效抑制了背景转录；2）该转录模板既能指导支架RNA的转录，又能作为ssDNA激活剂与支架RNA自组装成功能性crRNA，从而激活Cas12a，巧妙绕过了传统Cas12a对PAM序列的依赖，也无需外源添加预组装的crRNA或激活链；3）磁珠的引入实现了靶标富集并极大提升了局部反应动力学。三者协同作用，使系统对miRNA-21的检测限达到65.3aM，并具有良好的特异性。该方法成功应用于癌细胞和临床血清样本中miRNA-21的定量分析，结果与金标准RT-qPCR吻合，展示出强大的临床诊断潜力。该工作为CRISPR/Cas12a系统在分子诊断，尤其是微量核酸标志物检测中的应用，提供了一个新颖、高效且通用的平台。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118559