循环肿瘤DNA（ctDNA）是肿瘤细胞通过凋亡、坏死等途径释放到血液中的肿瘤特异性DNA片段，是一种极具前景的液体活检肿瘤标志物。然而，ctDNA在血液中含量极低（fM至pM水平）且半衰期短（通常<2小时），这对其检测提出了巨大挑战。目前检测ctDNA的经典方法主要为DNA测序和聚合酶链式反应（PCR），这些方法虽准确灵敏，但存在成本高、操作繁琐、需酶、需温控、耗时长等局限。等温扩增技术（如LAMP、RPA、RCA）提供了优异灵敏度，但其准确性可能受酶活性、纯化步骤及批次差异影响。

相比之下，无酶系统（如熵驱动扩增、催化发夹组装CHA、杂交链式反应HCR）更受欢迎，但它们通常涉及多步反应和复杂试剂，增加了操作复杂性。因此，开发一种简单、低成本且高灵敏度的ctDNA检测方法迫在眉睫。功能性DNA纳米材料，如DNA纳米球，因其可编程自组装、多价性、各向异性及可负载多种信号分子的特性，在生物传感领域展现出优势。特别是利用金属离子（如Ag⁺）与DNA碱基对（C-Ag⁺-C结构）的配位作用，可构建新颖的离子介导自组装纳米球。然而，单一的DNA纳米球在检测痕量核酸时灵敏度可能略有不足。将DNA纳米结构与化学信号放大方法（如阳离子交换反应CER）相结合，利用CuS纳米颗粒与Ag⁺反应置换出大量Cu²⁺，可实现高效的信号扩增。这种有机组合，结合合适的检测器（如电化学仪器），有望构建用于痕量核酸检测的通用系统。

研究内容

图1.分析原理

首先，三条具有特定设计的单链DNA（Y1, Y2, Y3）在银离子（Ag⁺）存在下，通过C-Ag⁺-C结构的配位作用以及回文序列的互补配对，自组装形成Y形DNA单体，并进一步耦合成DNA纳米球@Ag⁺，实现对靶标的初步捕获与信号分子的集成（I放大）。当靶标ctDNA EGFR L858R存在时，其通过碱基互补配对特异性识别并打开DNA纳米球@Ag⁺，释放出游离的Ag⁺。靶标浓度越高，释放的Ag⁺越多。随后加入硫化铜纳米颗粒（CuS NPs），释放的Ag⁺会通过阳离子交换反应置换出CuS NPs中的Cu²⁺，实现信号的进一步放大（II放大）。最终，通过差分脉冲伏安法检测溶液中Cu²⁺的电化学信号强度，即可实现对靶标L858R的定量分析。

图2.可行性验证

首先，通过透射电镜、电化学和电感耦合等离子体质谱证实了CuS NPs的成功合成及其与Ag⁺的阳离子交换反应，定量结果显示Ag⁺可置换出约9.3倍的Cu²⁺，实现了9.3倍的信号放大。原子力显微镜和动态光散射表征清晰显示了Y形DNA单体、DNA纳米球@Ag⁺的形成，以及靶标L858R加入后导致DNA纳米球@Ag⁺解离为片段的过程。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（使用了替代序列以避免Ag⁺干扰）进一步证实了Y形单体形成、DNA纳米球组装以及靶标触发纳米球解离释放低分子量产物的过程。

图3.ctDNA的分析性能

比较了有无CER辅助下的两种系统。无CER辅助时，以释放的Ag⁺为信号分子，检测限为33 aM。在CER辅助下，以置换出的Cu²⁺为信号分子，灵敏度得到极大提升，在1 aM 至 1 fM 浓度范围内呈良好线性，计算得出的检测限低至0.3 aM。该性能优于许多已报道的方法。传感器表现出良好的重现性（RSD=2.30%， n=11）和稳定性（4°C储存12小时后信号保留96%）。

图4.ctDNA分析的临床适用性

在健康人稀释血样中进行加标回收实验，回收率在95.5%至105%之间，表明复杂生物基质对检测干扰很小，方法可靠。随后，应用该电化学策略对42例临床血样（12例健康人，30例肺癌患者）进行了分析。结果显示，患者组的电化学信号显著高于健康组，两者存在统计学极显著差异。受试者工作特征曲线分析显示曲线下面积高达0.97，诊断灵敏度为93%，特异性为100%。此外，电化学检测结果与患者的计算机断层扫描和病理学结果高度一致。与经典qRT-PCR方法的对比也显示结果具有良好的一致性（R = -0.81）。

本研究成功开发了一种快速、均相（一锅法）的电化学分析方法，用于超灵敏检测肺癌相关ctDNA EGFR L858R突变。该方法创新性地整合了Ag⁺介导的DNA纳米球（I放大）和阳离子交换反应（II放大）构成的双重级联信号放大策略。其核心优势在于：1) 超高灵敏度：检测限达0.3 aM，这得益于DNA纳米球的高负载量、靶标触发的特异性解离以及CER的高效信号转换与放大；2) 操作简便：无需酶、无需温控、无需复杂的电极修饰，实现真正的一锅法均相检测；3) 高特异性与临床实用性：能有效区分单碱基错配，在42例临床血样中检测结果与qRT-PCR、CT及病理结果高度一致，展现出优异的诊断潜力。尽管目前仅能单靶标检测且总检测时间有待进一步缩短，但该方法为痕量核酸标志物的检测提供了一个强大、低成本且易于操作的新平台，在精准医疗和即时检测领域具有广阔的应用前景。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c06652