由真菌Sporisoriumscitamineum引起的甘蔗黑穗病是一种毁灭性病害，可导致高达70%的糖产量损失，并引发次生感染，严重威胁全球甘蔗产业。早期诊断（如接种后12小时）对于有效防控至关重要，其检测阈值可低至0.08aM。基于智能手机的生物传感器为即时检测提供了有前景的解决方案，但现有的单模式系统在农业应用中存在局限性。虽然多模态策略可通过正交信号交叉验证来减少假阳性，但现有平台缺乏与CRISPR核酸扩增技术的整合，而后者对于实现早期无症状感染所需的阿托摩尔级灵敏度至关重要。当前可现场部署的技术（如商业侧向流试纸条，检测限>1nM）无法达到此灵敏度阈值。

CRISPR-Cas12a系统因其程序化的反式切割活性已成为强大的分子诊断工具，但其单独使用时灵敏度有限（nM-pM级），需与预扩增技术（如滚环扩增RCA）结合。同时，工程化纳米酶（如Fe₃O₄@Au）因其多功能性（磁分离、催化等）在现场检测中显示出关键作用。因此，开发一种能整合纳米酶工程、CRISPR级联放大和多模态传感的现场部署平台，以满足精准农业对超灵敏、快速、可靠病害诊断的迫切需求，具有重要意义。

研究内容

图1.设备架构与运行机制

该系统核心是将RCA激活的CRISPR/Cas12a反式切割系统与双功能磁性纳米酶Fe₃O₄@Au结合，构建级联信号放大通路。靶标DNA被线性模板识别并环化，启动RCA反应，产生含有重复单元的ssDNA。这些重复序列作为激活剂，高效激活Cas12a的反式切割活性，切割Fe₃O₄@Au@GOD生物偶联物表面的GOD-ssDNA。随后，利用Fe₃O₄@Au的磁性进行分离，未反应的偶联物被磁吸附除去。上清液中的游离GOD用于比色/光热检测：催化葡萄糖产生H₂O₂，在HRP存在下氧化TMB产生蓝色产物（比色信号），该产物在808nm激光照射下产生光热效应。磁性沉淀物则作为生物阳极用于电化学检测，催化葡萄糖氧化产生电流信号。整个平台通过3D打印技术制成小型化检测模块，并与智能手机应用耦合，实现同步多模态分析。

图2.表征

TEM显示S-GDY呈典型的二维片状结构，具有丰富的皱褶，这提供了丰富的边缘活性位点并增强了电解质渗透性。高分辨TEM表明AuNPs均匀分散在Au/S-GDY表面，这得益于硫掺杂位点通过Au-S配位稳定锚定了AuNPs，为后续生物分子DNA探针的功能化修饰提供了高密度结合界面。XPS全谱证实了C、S、Au元素的存在。C1s精细谱显示了sp杂化C-C、sp²杂化C=C、C-O和C=O等多种键合构型。S2p谱图表明硫原子以C-S-C和C=S两种化学态成功掺入GDY骨架，部分硫在合成过程中被氧化。Au4f精细谱显示金属态Au⁰的特征峰，证实AuNPs通过物理吸附或弱化学键合稳定负载在S-GDY表面。

图3.Fe₃O₄@Au的表征

SEM显示Fe₃O₄@Au具有均匀的尺寸、规则的球形结构和丰富的介孔表面。BET分析显示其比表面积为15.23m²/g，具有丰富的多孔结构，这不仅为DNA负载提供了丰富的锚定点，也增强了反应底物的传质效率。UV-vis光谱显示，与Fe₃O₄相比，Fe₃O₄@Au在526nm处有明显的表面等离子体共振吸收增强，对应于Au纳米颗粒的特征峰，表明Au成功原位生长在Fe₃O₄上且未聚集。XPS全谱确认了Au、Fe、O元素的存在。Au4f精细谱显示Au⁰的特征峰。Fe2p精细谱显示了Fe₃O₄中Fe²⁺和Fe³⁺的特征峰。酶活性验证实验表明，Fe₃O₄@Au具有过氧化物酶和葡萄糖氧化酶样活性，其中过氧化物酶活性主要来源于Fe₃O₄，而葡萄糖氧化酶活性可能源于AuNPs。

图4.三模态传感平台的可行性分析

使用循环伏安法和电化学阻抗谱评估了阴极和生物阳极界面的逐步修饰过程。阴极修饰（Au/S-GDY、dsDNA、MCH）有效降低了电荷转移电阻，并随着dsDNA负载量增加，[Ru(NH₃)₆]³⁺的还原峰电流显著增强，改善了电流响应。生物阳极的逐步修饰（Au/S-GDY、H1探针、MCH、靶标触发的RCA-Cas12a切割产物）导致电荷转移电阻发生规律性变化，CV还原峰电流相应降低，揭示了靶标识别过程中电极界面电子转移的动态变化。实验验证了[Ru(NH₃)₆]³⁺作为氧化还原探针的必要性。最后，通过对比实验证实，靶标存在时，RCA-CRISPR/Cas12a系统激活并切割Fe₃O₄@Au@GOD，导致电化学信号增强（因阳极表面GOD密度降低），同时上清液中游离GOD催化产生比色和光热信号，实现了三重模式的可行性验证。

图5.实验条件优化

通过CV监测不同Cas12a浓度（10-200nM）和反应时间（30-90分钟）下Fe₃O₄@Au@GOD表面ssDNA的切割效率，确定最优Cas12a浓度为100nM，最优切割时间为60分钟。优化了辅助酶系统：phi29DNA聚合酶的最佳作用时间为60分钟；T4DNA连接酶的环化反应最佳时间为60分钟。最后，优化了Fe₃O₄@Au@GOD与发夹H1的结合时间，确定120分钟为最佳结合时间，此时可形成均匀的单层结构，避免材料聚集导致的信号衰减。

图6.三模态传感平台的分析性能

在电化学模式下，瞬时电流值随靶标浓度对数增加而规律性下降，在0.0001-100pM范围内呈良好线性，检测限低至32.11aM。在比色模式下，通过智能手机RGB分析，R/B值与靶标浓度对数呈负相关，在0.1-10000pM范围内线性良好，检测限为49.28fM。在光热模式下，利用oxTMB在808nm激光下的光热转换特性，温度变化与靶标浓度对数呈正相关，检测限为42.17fM。三种模式的结果共同表明，构建的RCA-CRISPR/Cas12a系统能灵敏响应靶标浓度变化，多模式联用显著提高了检测的可靠性，为田间快速诊断提供了多维策略。

图7.三模态传感平台的特异性、稳定性与重现性

重复性实验显示，电化学、比色和光热模式的RSD值分别为0.84%、0.98%和1.39%，表明传感器具有良好的重现性。稳定性测试（4°C储存12天）显示，三种模式的信号保留率分别为99.26%、98.55%和98.51%，表明传感器稳定性良好。特异性实验使用了双碱基错配序列、单链核酸、苯硼酸及其混合物作为干扰物（浓度是靶标的100倍）。结果表明，仅在靶标存在时，传感器的信号与干扰物信号有显著区分，证明了其高特异性。研究还展示了集成了便携式激光器、热成像设备和万用表的新型便携式检测装置，并通过智能手机直观演示了光热检测过程，验证了其实际应用的便捷性和有效性。

本研究成功构建了一个集成了纳米材料、CRISPR生物技术和智能手机读出的智能便携式多模态检测系统，用于甘蔗黑穗病的快速精准诊断。该平台的核心创新在于协同结合了三功能Fe₃O₄@Au纳米酶（实现高效磁分离和双酶模拟催化）、RCA-CRISPR/Cas12a级联放大（实现阿托摩尔级灵敏度）以及正交三模验证（电化学/比色/光热），显著降低了复杂植物基质中的假阳性。这种集成方法使得完整的样本到结果检测可在2.5小时内完成，与实验室方法相比成本降低80%，同时保持了高准确性。可现场部署的3D打印设备与智能手机操作界面相结合，使非专业用户也能进行可靠的现场病原体监测。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117985