一种基于纳米抗体的单一硫代噬菌体展现的生物传感器用于无标记检测食源性病原体

  背景：细菌感染对全球公共卫生构成严重威胁。因此，快速和灵敏地检测细菌病原体对环境和食品安全、人类健康以及医疗诊断至关重要。基于培养的方法是目前细菌分析的金标准，该方法廉价、准确，但具有费力、费时和低通量的局限性。近年来，致病菌快速灵敏检测技术众多，其中核酸检测和免疫检测是最常用的。然而，以聚合酶链反应(PCR)为基础的核酸方法通常需要昂贵的设备和训练有素的操作人员。传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)存在耗时长和灵敏度低等缺点。因此，开发一些简单、快速、稳定、灵敏的细菌检测策略是非常有必要的。

  比色生物传感由于其可视化读数、便携性和低成本特点，已在环境监测、食品污染物分析和医疗诊断中引起了相当广泛的关注。AuNPs具有制备简单、生物相容性好、消光系数高、独特的局部表面等离子体共振(LSPR)特性等优点。由于纳米颗粒之间距离的缩短而引起的AuNPs间交联会诱导金的聚集，导致溶液的颜色由红色变为紫色，因此很容易用肉眼识别。

  噬菌体(Bacteriophages/phages)在较宽的温度和pH范围内具有高稳定性，在生物传感器应用中具有巨大的潜力。然而，天然噬菌体很难满足实验所需的宿主特异性。大多数天然噬菌体的繁殖性能较差，方案标准化比较困难。此外，天然噬菌体的大规模应用容易受到噬菌体污染，从而影响工业生产。基于噬菌体的生物传感器是通过感染或基因工程获得的噬菌体表面显示的特定蛋白识别目标来实现对细菌的分析。单结构域抗体，也称为纳米抗体(Nbs)，是可以显示在噬菌体颗粒表面的有效配体。

  方法：使用免疫骆驼血清构建噬菌体-Nb文库。通过三轮生物筛选，获得了针对副溶血性弧菌特有的噬菌体-Nbs。硫代化后，噬菌体表面的巯基诱导了AuNPs的聚集，而与细菌的相互作用由于空间位阻而阻止了聚集，导致溶液颜色和光学强度光谱的变化。

  图1.构建基于硫醇化噬菌体显示纳米体的一步比色免疫传感器，用于副溶血弧菌检测。(a)构建免疫噬菌体展示纳米体文库的概要。(b)抗副溶血性葡萄球菌噬菌体-Nbs的生物淘选。(c)通过EDC化学对噬菌体-Nb进行硫醇化和拟议的副溶血弧菌检测比色法。

  图2. (a)在生物筛选周期中对噬菌体-Nbs的富集. (b)噬菌体-Nbs ELISA用于鉴定与副溶血性弧菌结合的阳性克隆 (c)对噬菌体-Nbs的氨基酸序列进行比对，指出了可变互补决定区域(CDR)和框架(FR)(d)副溶血性噬菌体-Nbs(噬菌体-Nb6、噬菌体-Nb8、噬菌体-Nb16、噬菌体-Nb20、噬菌体-Nb23)的间接ELISA。将所有噬菌体-Nbs稀释至浓度为5×1010 pfu/mL。(e)抗副溶血性弧菌噬菌体-Nbs对10种不同类型的食源性病原体(金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、伦敦链球菌、肠炎链球菌、痢疾链球菌、大肠杆菌、流感弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌)的特异性。将所有病原体稀释至浓度为1×108 CFU/mL。(f)纳米体结构模型

  图3. 采用(a)肉眼一步比色免疫传感器和(b)紫外-可见光谱法检测副溶血性弧菌。该免疫传感器的(c)校准曲线。(d)免疫传感器对9种非目标食源性病原体(金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、伦敦链球菌、肠炎链球菌、痢疾链球菌、大肠杆菌、流感弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌)和浓度为106 CFU/mL时的特异性。

  结果：在固相包被抗原上进行连续三轮生物筛选后，观察到特异性噬菌体明显富集，从2×103 pfu到1.4×106 pfu(图2a)。第三轮筛选后，从滴定板中随机抽取32个克隆，其中26个克隆经phage-ELISA鉴定为阳性(图2b)。在所有分析的克隆中，获得了5个不同的VHH家族，通过DNA测序证实(图2c)。采用间接ELISA法比较噬菌体的灵敏度和特异性，这些噬菌体在筛选过程中去除非特异性吸附后均具有良好的响应信号和特异性(图2d-e)。最终选择噬菌体-Nb20进行后续实验。Nb20的结构模型采用SWISS-MODEL进行了预测(图2f)。噬菌体-Nbs的高特异性是由Nbs蛋白的三个不同的CDR区域赋予的。CDR1和CDR3区域比传统抗体长，增加了抗原结合位点的面积，CDR3区域形成暴露的大凸环结构，可完全接触一些隐藏的抗原表位。

  溶液颜色由紫色变为红色，表明存在副溶血性弧菌。肉眼检测的检测限(LOD)为104 cfu/mL(图3a)。图6d显示，只有在副溶血性弧菌存在的情况下，Δ(A524/A682)值呈阳性，而其他细菌产生的响应信号与空白溶液几乎相同。这些结果表明，所提出副溶血性弧菌比色法具有很高的特异性，这归因于噬菌体-Nb的高特异性。

  结论：从纳米抗体文库中选择的噬菌体-Nb能够特异性地识别副溶血性弧菌，且该反应与其他常见病原菌无交叉反应。基于硫代化噬菌体-Nbs诱导的AuNPs聚集的新型传感器平台，可用于快速、灵敏和选择性地检测细菌病原体。

  参考来源：Wang P, Yu G, Wei J, et al. A single thiolated-phage displayed nanobody-based biosensor for label-free detection of foodborne pathogen[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 443: 130157.