把细菌指纹放大：液滴收缩辅助SERS快速识别单核细胞增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌是肉类及即食禽肉制品中需要重点关注的食源性致病菌，其引起的李斯特菌病虽然发病率相对有限，但住院率和致死风险较高，孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低下人群尤为易感。由于该菌能够在低温环境下存活甚至生长，常规冷藏并不能完全消除其污染风险，这使肉制品加工、储运和消费环节中的快速监测具有重要意义。传统平板计数法虽然被视为可靠方法，但检测周期长，结果具有滞后性，难以及时服务于食品安全预警。免疫检测和核酸检测在一定程度上提高了检测效率和灵敏度，但前者可能受到假阳性影响，后者通常需要细菌裂解和序列扩增，操作相对复杂，也不利于区分活菌与死菌。因此，发展一种操作简便、快速灵敏、能够直接识别目标菌的检测方法十分必要。本研究正是围绕这一需求，将免疫磁富集与液滴收缩辅助无标记SERS结合，通过先特异性捕获目标菌、再放大其自身拉曼指纹信号，实现复杂肉样中单核细胞增生李斯特菌的快速识别与定量检测，为肉类食品安全监测提供了新的技术思路。

一、设计原理

本研究的设计思路是先“抓住”目标菌，再“放大”细菌自身的分子指纹。具体而言，抗体修饰的免疫磁珠先从复杂肉样中选择性捕获单核细胞增生李斯特菌，并通过磁分离去除样品基质干扰；随后加入银纳米颗粒，在液滴蒸发收缩过程中，纳米颗粒逐渐富集并贴附到细菌表面，形成局部增强热点，从而放大细菌细胞壁成分的拉曼指纹信号。该方法不依赖外源标记或核酸扩增，而是直接读取目标菌自身的SERS指纹，实现快速、灵敏的识别与定量检测，整体流程如图1所示。

图1  免疫磁富集联合液滴收缩辅助无标记SERS识别单核细胞增生李斯特菌的原理与流程

二、纳米颗粒的选择与体系优化

纳米颗粒是放大细菌拉曼指纹信号的关键。图2比较了银纳米颗粒、金纳米颗粒和金核银壳纳米颗粒的增强效果。三者均能增强单核细胞增生李斯特菌的SERS信号，但银纳米颗粒产生的特征峰最强、最清晰，因此更适合作为本研究的增强基底。这些特征峰主要来源于细菌细胞壁中的肽聚糖、表面蛋白及相关氨基酸结构，说明该方法读取的是细菌自身的分子指纹，而不是外加标记信号。

在SERS检测前，离心收集后的细菌需要重新分散到液体中，使其能够与银纳米颗粒充分混合，并在液滴蒸发过程中形成“细菌-纳米颗粒”复合物。因此，用于重新分散细菌的溶液组成会直接影响纳米颗粒的稳定性和其在细菌表面的吸附效果。实验结果显示，超纯水条件下拉曼信号最强，而PBS和生理盐水中的信号较弱，说明较高离子强度可能诱导银纳米颗粒聚集，减少其与细菌表面的有效接触。银纳米颗粒浓度同样需要控制在适当范围内，浓度过低时增强热点不足，浓度过高时颗粒自身聚集反而削弱信号。经过条件优化后，该体系能够获得清晰、稳定的单核细胞增生李斯特菌SERS指纹，并实现灵敏检测，如图3所示。

图2  不同金属纳米颗粒增强单核细胞增生李斯特菌SERS指纹及特征峰归属

图3  液滴收缩条件对单核细胞增生李斯特菌无标记SERS检测性能的影响。显微图像和粒径结果表明，纳米颗粒主要富集于细菌表面，并未造成明显细菌团聚。检测条件优化结果显示，超纯水更有利于获得强信号，银纳米颗粒浓度以10 mM较优；在优化条件下，该无标记SERS方法可在10²至10⁷ CFU/mL范围内实现线性检测，检出限为30 CFU/mL。

三、实际性能检测验证

为验证方法能否用于真实样品检测，研究先构建了抗体修饰的免疫磁珠。磁珠表面连接抗单核细胞增生李斯特菌抗体后，粒径发生轻微增加，说明抗体已成功修饰到磁珠表面。随后，研究优化了免疫磁珠用量和捕获时间，结果表明，30 μg免疫磁珠和40 min孵育时间能够获得较好的目标菌捕获效果。扫描电镜结果也显示，只有抗体修饰后的磁珠才能明显结合单核细胞增生李斯特菌，说明该富集过程主要依赖抗体与目标菌表面抗原之间的特异性识别。

在完成免疫富集条件优化后，研究进一步考察了方法的选择性和检测性能。免疫磁珠对不同单核细胞增生李斯特菌菌株均表现出较强捕获能力，而对大肠杆菌和沙门氏菌等非目标菌的捕获较弱，说明该方法能够在复杂样品中优先富集目标菌。将免疫磁富集与液滴收缩辅助无标记SERS结合后，目标菌浓度越高，拉曼指纹信号越强，并在10至10⁷ CFU/mL范围内呈现良好的线性关系，检出限达到7 CFU/mL。最后，研究将该方法用于鸡肉样品加标检测，检测结果与传统平板计数法基本一致，表明该方法兼具特异性、灵敏度和实际样品适用性，可用于肉类样品中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测，如图4所示。

图4  免疫磁富集联合液滴收缩辅助SERS检测单核细胞增生李斯特菌的性能验证。该图展示了免疫磁珠制备与捕获条件优化、非目标菌特异性比较、不同浓度目标菌的SERS响应，以及鸡肉样品加标检测结果与平板计数法的对比，说明该方法具备较好的富集能力、选择性、灵敏度和实际样品适用性。

综上，本文建立了一种免疫磁富集联合液滴收缩辅助无标记SERS的单核细胞增生李斯特菌检测方法，其创新性在于没有依赖外源标记探针或核酸扩增，而是先通过免疫磁珠从复杂肉样中选择性捕获目标菌，再借助液滴蒸发收缩促使银纳米颗粒富集于细菌表面，从而直接放大并读取细菌自身的拉曼指纹。该策略将目标菌富集、基质干扰去除、纳米颗粒原位组装和分子指纹识别整合在同一检测流程中，提高了复杂食品样品中低丰度病原菌快速识别的可行性，也为食源性致病菌检测提供了区别于传统免疫检测和核酸检测的新思路。不过，该研究仍存在一定局限：目前主要在鸡肉加标样品中验证方法性能，真实食品样品类型和自然污染样本数量仍需进一步扩大；部分拉曼特征峰的分子归属仍有待更深入确认；同时，SERS信号稳定性仍受纳米颗粒分布、液滴干燥条件和仪器平台影响。未来研究可进一步拓展更多真实食品基质、自然污染样本和不同菌株验证，完善拉曼指纹数据库与特征峰解析，并结合便携式拉曼设备和标准化样品处理流程，推动该方法向现场快速筛查和食品安全常规监测应用转化。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c05756