基于 CRISPR/Cas 系统的致病菌检测策略

1.引言

致病菌（如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌、副溶血性弧菌）危害公共健康，传统检测方法耗时、操作复杂、易出现假结果。CRISPR/Cas 系统凭借核酸高特异性识别与切割能力，成为快速、灵敏检测的核心平台，可结合核酸扩增技术（LAMP、PCR、RPA、RAA）与比色、荧光、SERS、电化学等信号模式，适配食品安全、临床、环境等场景。

2.结果与讨论

CRISPR/Cas 系统工作机制

CRISPR/Cas 对入侵外源遗传物质具有三步免疫过程：

1）外源 DNA 捕获：识别噬菌体 / 质粒外源序列并整合到自身 CRISPR 位点；

2）crRNA 合成：转录加工形成成熟 crRNA；

3）靶向干扰：crRNA 引导 Cas 蛋白特异性识别并切割靶核酸，实现防御。

该机制赋予 CRISPR/Cas 高特异性、可编程的核酸识别能力，为致病菌检测奠定基础。

不同 Cas 蛋白切割原理

Cas9：需要 PAM，切割双链 DNA，形成平末端；

Cas12：识别 PAM，切割双链 DNA，且附带非特异性单链切割；

Cas13：靶向 RNA，识别 PFS，激活后附带切割周围 RNA；

Cas14：不依赖 PAM，靶向单链 DNA，序列不依赖切割。

不同 Cas 蛋白底物偏好与激活方式不同，决定其在检测中的应用场景：Cas12/Cas13 适合信号放大，Cas14 无 PAM 限制，适用性更广。

CRISPR/Cas 联合检测策略CRISPR/Cas 可与核酸扩增（PCR、RPA、RAA、LAMP、SDA）及多种信号输出（比色、荧光、化学发光、SERS、电化学）联用，形成多模式检测体系。

扩增提升灵敏度；

多信号适配现场快速、可视化、便携检测。

Cas9 检测致病菌

Cas9+LFS：沙门氏菌，可视化，100 CFU/mL；

Cas9 + 荧光探针：大肠杆菌 O157:H7，40 CFU/mL；

Cas9 + 多重 LFS：同时检测大肠杆菌、沙门氏菌；

Cas9+SERS：多重耐药菌，fmol 级灵敏度。

优点：成熟、可视化、便携；缺点：脱靶率偏高。

Cas12 检测致病菌

Cas12 + 比色：创伤弧菌；

Cas12 + 荧光：鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌；

Cas12 + 电化学：李斯特菌。

特点：反式切割强、灵敏度高（可达 1 CFU/mL）、多联用适配。

Cas13 检测致病菌

Cas13+PCR：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌；

Cas13 + 微流控：单分子 RNA 检测，无需扩增；

Cas13 + 化学发光：食品样本现场检测。

优势：RNA 靶向、可直接检测转录本；缺点：需转录步骤，流程较长。

4.总体结论

CRISPR/Cas 凭借高特异性、可编程、强信号放大，成为致病菌检测的主流技术。

Cas12：综合性能最优，应用最广；

Cas13：适合 RNA 层面检测；

Cas14：无 PAM 限制，靶序列选择更自由；

局限：脱靶、PAM 依赖、部分需扩增、现场设备依赖。

未来方向：降低脱靶、无扩增化、便携化、多重并行检测，推动基层、现场快速诊断落地。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.trac.2025.118497