给细菌贴上“荧光标签”：一种35分钟识别血流感染病原体的新方法

设计原理

血流感染病原菌识别的核心矛盾在于：临床需要尽快明确感染“元凶”，但传统流程通常要在血培养报阳后继续分离培养，再进行MALDI-TOF MS或自动化系统鉴定，时间成本较高。本文的设计思路是把细菌响应型RNA切割荧光DNAzyme探针与流式细胞术微球悬浮阵列结合起来。不同荧光编码微球负责区分检测对象，相当于给不同病原菌探针分配“身份标签”；RFD探针负责把目标菌裂解液中的响应信号转化为FAM荧光增强。这样，即使所有阳性反应都通过同一个FAM通道读取，也可以根据微球编码判断信号来自哪一种菌，实现单管多重检测（Scheme 1）。该方法的关键并不是直接识别完整细菌，而是通过样本前处理释放细菌来源的RFD激活成分，再触发对应DNAzyme切割反应并产生荧光信号。

Scheme 1  RFD功能化微球悬浮阵列用于血流感染病原菌的多重检测原理

研究内容与结果

作者首先建立了RFD探针产生荧光信号的基本逻辑。RFD探针由DNAzyme催化结构和带有荧光基团、淬灭基团的底物链组成，未被激活时荧光较低；当目标菌裂解液中的相关成分激活DNAzyme后，底物链被切割，荧光基团与淬灭基团分离，FAM信号增强（图1a）。在单探针验证中，作者以金黄色葡萄球菌探针RFD-SA为代表，观察到其在目标菌裂解液存在时产生时间依赖性荧光增强，并且目标菌浓度越高，信号越明显（图1b）。进一步的选择性实验显示，RFD-SA对MSSA和MRSA均有明显响应，而对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌等非目标菌未见明显交叉反应（图1c）。这说明RFD-SA具备识别金黄色葡萄球菌裂解液的能力，也为后续将探针固定到微球上提供了基础。为了实现多重检测，作者将不同RFD探针分别固定到不同荧光强度编码的磁性微球上。四类微球在APC通道中可以被流式细胞仪区分为不同群体，每一群对应一种病原菌探针，包括RFD-SA、RFD-EC、RFD-KP和RFD-CD（图1d）。当混合体系中加入四种目标菌裂解液后，对应微球群均出现FAM荧光增强，说明流式细胞仪可以同时读取“微球身份”和“探针反应”两类信息，从而实现多种病原菌的同步判断（图1e）。对于单一微球传感单元，加入对应目标菌后，FAM荧光峰相对于阴性对照向高荧光区域移动，也就是常说的“右移”（图1f）。

图1  RFD功能化微球传感单元的构建及多重检测可行性验证

在完成平台构建后，作者重点验证了固定化RFD微球传感单元的特异性和浓度响应。四种传感单元分别与目标菌和多种非目标菌裂解液孵育后，只有对应目标菌能够引起明显FAM荧光右移，非目标菌处理组未出现类似变化（图2a至图2d）。这一结果说明，RFD-EC、RFD-KP、RFD-SA和RFD-CD微球主要响应各自目标菌，不容易被其他常见病原菌误激活。随后，作者用不同浓度的目标菌裂解液进行检测，发现随着菌量升高，FAM荧光峰逐渐向高强度区域移动，表现出浓度依赖性响应（图2e至图2h）。文章报告该平台的检测限达到约10³ CFU/mL量级，提示其具备进一步用于阳性血培养样本检测的分析性能基础。

图2  RFD功能化微球传感单元的特异性与浓度响应验证

由于RFD探针依赖细菌来源成分的释放，真实血培养样本的前处理成为影响检测效果的关键。作者设计了包括样本转移、细菌富集和裂解在内的处理流程，以促进RFD激活成分释放（图3a）。不同处理方式比较显示，适当的富集和裂解可以增强临床样本中的可检测荧光信号，而未经充分处理的样本难以有效触发RFD反应（图3b）。这说明该方法并不是简单地把血培养液直接加入探针体系，而是需要通过前处理把复杂临床样本转化为适合RFD反应的检测对象。作者还比较了需氧血培养瓶和厌氧血培养瓶来源样本的检测情况，结果提示该流程对不同血培养瓶体系具有一定兼容性（图3c）。

图3  血培养样本前处理对RFD微球检测信号的影响

最终，作者将该平台用于真实临床血培养样本验证，并与医院常规鉴定方法进行比较。临床结果热图显示，RFD-FCM平台与VITEK 2、MALDI-TOF MS等常规方法总体具有较好一致性（图4a）。以大肠埃希菌阳性样本为例，EC对应微球群的FAM荧光分布相对于阴性对照明显右移，说明真实血培养样本中的目标菌相关成分可以激活RFD-EC探针（图4b）。定量分析进一步显示，EC阳性样本的平均荧光强度显著高于对照样本，说明该差异可以被统计学区分，而不是单纯依赖主观观察（图4c）。在135份临床样本中，该方法对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌与常规鉴定结果的一致性达到较高水平，对肺炎克雷伯菌也显示出一定识别能力，并能识别部分双重感染样本。不过，肺炎克雷伯菌和艰难梭菌的检测表现提示，菌体裂解效率仍可能影响检测准确性，尤其是高黏液性或细胞结构较难破坏的菌种。

图4  RFD-FCM平台在临床血培养样本中的检测性能验证

结论

总体而言，本文提出了一种基于细菌响应型RFD探针与荧光编码微球悬浮阵列的血流感染病原菌快速多重检测策略。该研究通过利用目标菌裂解液中能够激活RFD的细菌来源分子，将其转化为可由流式细胞仪读取的FAM荧光信号。需要注意的是，文章并未进一步鉴定这些RFD激活分子的具体身份，因此该方法在识别机制上仍带有一定“黑箱”特征。其创新性在于通过微球编码解决多靶标区分问题，通过RFD切割反应实现信号放大，并将二者整合到适合临床实验室读取的流式平台中，从而实现阳性血培养瓶样本中多种病原菌的同步识别。该平台有望缩短血培养报阳后的病原菌鉴定时间，为早期精准抗感染治疗提供辅助。局限性在于，该方法仍依赖阳性血培养瓶，尚不能直接用于原始血液样本；RFD激活分子的具体组成和作用机制尚未阐明；部分菌种的检测效果受裂解效率影响较大；同时，临床验证样本量有限且来自单中心，仍需进一步扩大样本并优化前处理流程。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.microc.2026.116941