一体化微流控智能检测平台：实现三种耐药菌的快速精准识别

一、从核酸检测到“非核酸靶标智能放大识别

抗生素耐药菌（ARB）如MRSA、CRPA和KPC-2 KP的快速传播，对公共健康构成严重威胁。传统检测方法如培养法、平板计数和qPCR虽然可靠，但存在耗时长（2–3天）、设备依赖强、难以现场应用等局限，无法满足突发公共卫生事件的快速响应需求。为解决上述问题，本研究提出一种基于EDC调控CRISPR/Cas12a信号放大的便携式PSDA检测平台（图1），其核心设计包括以下四个方面：①适配体识别模块：利用特异性适配体识别目标耐药菌，实现对非核酸目标的精准捕获；②EDC循环信号放大系统：通过entropy-driven catalysis（EDC）循环结构放大识别信号，提高检测灵敏度；③CRISPR/Cas12a信号转换模块：将识别信号转化为Cas12a激活信号，实现荧光输出；④ZGM@BHQ1纳米信号增强体系：作为分子信标，提高信噪比，进一步降低检测限。该体系实现了从“菌体识别”到“荧光信号输出”的高效转化，并兼具多重检测能力与便携性。

图1：PSDA微流控CRISPR/Cas12a多重耐药菌检测平台设计原理与系统架构

二、多重检测能力与体系稳定性验证

体系构建完成后，需对其多重检测能力与抗干扰性能进行系统验证。如图2所示，单靶检测时，各目标菌可特异性激活对应反应单元，产生显著荧光信号，而非目标菌（如MSSA、CSPA、CSKP及大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌等）无明显荧光响应，背景信号与空白对照相近，表明锁定激活剂具有高度特异性。进一步对混合样本（MRSA+CRPA、MRSA+KPC-2 KP、CRPA+KPC-2 KP及三者混合）进行测试，各反应单元均能准确区分对应靶标，无交叉干扰，荧光强度与单靶检测一致。该结果充分说明，平台通过适配体识别-EDC放大-CRISPR转换的级联机制，结合微流控芯片的空间隔离设计，实现了优异的多重检测能力与抗干扰能力，为复杂样本中多种耐药菌的同步筛查提供了可靠保障。

图2 复杂基质样本中PSDA平台抗干扰检测能力与直接应用性能验证

三、灵敏度与动态范围分析

在优化条件下，PSDA平台对三种耐药菌展现出优异的定量分析性能。该平台在1–10⁷ CFU/mL范围内均呈现良好的线性关系（图3），检测限低至1 CFU/mL，信号在30 min内快速达峰并趋于稳定，在复杂基质中仍保持稳定响应。同传统荧光探针和qPCR相比，PSDA平台在灵敏度、速度和操作便捷性上实现了良好平衡，能够满足早期感染检测的临床需求。

图3 ZGM@BHQ1探针光学性质及荧光响应性能分析

四、复杂食品与临床样本应用验证

为评估PSDA平台的实际应用性能，研究在牛奶、鸡蛋和肉类等复杂食品基质中进行加标回收实验。结果显示，三种耐药菌的回收率均处于理想区间（MRSA：94.72%–105.45%；CRPA：93.24%–107.41%；KPC-2 KP：97.64%–111.60%），与平板计数法的一致性高达95.48%–115.15%，印证了平台对复杂食品基质的抗干扰能力与检测准确度。进一步在血液样本中验证发现，该平台可直接进行无前处理检测，血液颜色与成分对荧光信号影响极小，灵敏度仍维持1 CFU/mL水平，体现了其在临床样本直接检测中的适用性。此外，该平台重复性测试RSD均<<7%，满足生物传感器验证标准，冻干试剂在4℃保存4周后仍保持92%以上活性，为资源有限场景下的现场部署提供了稳定性保障。

图4 PSDA微流控平台综合性能评估及多场景现场检测可行性验证

结论

本研究构建了一种便携式PSDA微流控CRISPR/Cas12a检测平台，实现了三种重要抗生素耐药菌的快速、灵敏和多重检测。该平台通过适配体识别、EDC循环放大与CRISPR信号转换的协同作用，使检测限达到1 CFU/mL，并可在45分钟内完成检测，兼具低成本、高特异性及优异稳定性等优点。尽管该平台在食品与血液样本中表现优异，但仍存在样品前处理依赖较强、全自动化程度有限等问题。未来可通过集成样本预处理模块与自动控制系统，实现真正的全流程一体化现场检测，并扩展至更多耐药菌种类的联合检测

原文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.5c03012