一“粒”锁定：便携式水凝胶阵列，实现食品AFB1的早期预警

黄曲霉素B1（AFB1）是曲霉属真菌产生的剧毒、强致癌真菌毒素，对粮食供应造成严重污染和健康威胁。传统AFB1检测方法（如HPLC、LC-MS）以及近年来发展的免疫/适体传感器多在污染发生后进行，无法避免经济损失。因此，检测策略正转向监测AFB1生物合成的前体分子，特别是在基因层面。aflD基因在AFB1生物合成中起关键调控作用，对其早期检测可实现污染发生前的预警。

传统的aflD基因检测方法如PCR、qRT-PCR等存在耗时长、设备复杂、不适于现场检测等缺点。荧光生物传感器虽然操作简单、灵敏度高，但常规方法存在荧光探针化学标记成本高、程序繁琐、溶液中目标ssDNA扩散不受控制导致识别效率低和检测时间长等固有挑战。

为克服这些限制，受自然界空间限制机制启发的新型生物传感平台受到关注。水凝胶作为一种柔软、可调的软材料，为富集生物识别元件提供了理想的微环境。然而，传统水凝胶的多孔网络导致分析物扩散缓慢，限制了其灵敏度和响应速度。具有工程化空间限制的纳米结构材料通过局部浓缩分析物和限制布朗运动，可显著提高分子识别效率，但将空间限制效应整合到水凝胶生物传感器中以实现基因快速、无标记检测的研究尚不充分。

研究内容

图1.VLM的合成与性质

VLM分子结构包含一个富电子的咔唑单元，通过乙烯桥连接两个作为强电子受体的喹啉鎓基团。这种双阳离子特性增强了其在水溶液中的溶解性，并增加了与带负电荷的DNA磷酸骨架的亲和力。与SYBRGreenI等嵌入染料不同，VLM优先通过静电相互作用结合在双链DNA的小沟中，而非嵌入碱基对之间。这种结合方式减少了对DNA双螺旋的扰动，使其对dsDNA的选择性高于ssDNA，并确保了更强的荧光响应和稳定性。在dsDNA存在时，分子内运动受限，导致荧光显著增强。UV-vis吸收光谱在~465nm处有一个宽吸收带，表明存在显著的分子内电荷转移，这有助于其高信号强度。

图2.氧化石墨烯（GO）与PEG水凝胶颗粒阵列的表征

采用超疏水基底上的超亲水微孔图案化技术，成功制备了排列整齐的PEG-COOH水凝胶颗粒阵列。水接触角测量证实了基底超疏水性与水凝胶超亲水性的显著差异。扫描电镜显示干燥后的水凝胶具有致密的表面结构，孔径分析表明其具有相互连通的多孔网络，平均孔径为1.07±0.76μm，适合分析物扩散。

图3.aflD基因在PEG-COOH水凝胶颗粒上的分布

对于带负电的PEG-COOH水凝胶颗粒，带负电的cDNA/VLM复合物主要局限在水凝胶颗粒的外层水壳中。随着外层水分蒸发，该区域的cDNA/VLM浓度增加，荧光强度随之增强。LSCM断层扫描图像进一步证实，cDNA/VLM复合物主要分布在基质的外围区域，这归因于带负电的水凝胶网络与带负电的cDNA/VLM复合物之间的静电排斥力，抑制了其向水凝胶内部的扩散。Zeta电位测量结果（PEG-COOH、GO和cDNA/VLM均带负电）支持了静电排斥作用的解释。此外，在37°C时cDNA/VLM复合物荧光强度最高。

图4.水凝胶颗粒生物传感器对aflD基因的设计原理与优化

当目标aflD基因存在时，其与cDNA结合形成dsDNA，使VLM嵌入并恢复荧光。PEG-COOH水凝胶表面的致密结构阻止了cDNA/VLM进入内部，但通过空间限制效应，可以在其表面观察到由cDNA/VLM富集形成的荧光亮壳。优化实验表明，GO浓度增至100μg/mL时，对cDNA/VLM的淬灭达到平台期；淬灭时间20分钟为最佳。较小的水凝胶孔径和负表面电荷共同作用，实现了对aflD基因在颗粒表面的最佳富集。

图5.水凝胶颗粒生物传感器对aflD基因的性能评估

荧光图像显示，随着aflD基因浓度（0.05至2000nM）增加，荧光强度逐渐增强，表明cDNA/VLM/aflD基因复合物形成。三次平行实验显示出良好的重现性。荧光强度与aflD基因浓度在50-1000nM范围内呈良好线性关系，检测限为19.05nM，相关系数R²为0.998。动力学性能尤为突出：加入10μMaflD基因后，荧光恢复在15秒内即可发生。相比之下，在常规体相溶液中达到最大信号需要3600秒。水凝胶颗粒平台将DNA杂交速度提升了240倍。

本研究成功开发了一种基于空间限制水凝胶颗粒的生物传感平台，用于aflD基因的快速、无标记荧光检测，以实现AFB1污染的早期预警。该平台利用PEG-COOH水凝胶颗粒的空间限制效应，将目标DNA浓缩于外层水层，极大加速了DNA杂交动力学，检测时间仅需15秒，比传统体相方法快240倍。集成氧化石墨烯有效降低了背景干扰，而新型V形双阳离子荧光染料VLM通过与dsDNA选择性结合产生强荧光开启响应，确保了高特异性。该传感器检测限为19.05nM，线性范围50-1000nM，并成功应用于玉米粉实际样本检测。尽管灵敏度相较于某些基于扩增的方法有提升空间，但其无标记、超快速、操作简单的特点，使其成为现场、实时监测食品中AFB1污染风险的一个强大且实用的工具。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5c04105.