Biosensors and Bioelectronics：化学发光类过氧化物酶 DNA 纳米机器实现食品基质中金黄色葡萄球菌的高选择性检测

在新鲜果蔬供应链中，真正决定检测价值的往往不是“实验室里能不能测出来”，而是能否在产品短货架期内，用足够简单的设备尽快给出可靠结果。金黄色葡萄球菌作为常见且危害显著的污染菌，一旦进入即食蔬菜等高风险食品，就可能在很短时间内带来食物中毒风险。传统培养法虽然能确认活菌存在，但通常需要 24 至 72 h 才能给出初步结果；PCR 虽然更快，却依赖热循环仪和专业人员；等温扩增虽然更接近现场应用，但在复杂食品基质中仍容易受抑制剂和气溶胶污染影响。围绕这种“实验室准确性”与“现场可用性”之间的矛盾，本研究提出了一条新的技术路线。

研究者将关注点放在工程化 DNA 纳米机器上，尤其是基于 G-四链体/血红素 DNAzyme 的类过氧化物酶体系。与依赖蛋白酶、Cas 蛋白或复杂电极的方案相比，这类 DNA 构件本身具有可编程性强、稳定性更高、常温反应友好以及无需昂贵仪器即可读出的优势。其核心思路是：先通过靶标诱导使分裂状态的 G-四链体片段重新组装，再与血红素结合形成具有类过氧化物酶活性的复合体，最后催化 luminol-H₂O₂ 体系发出化学发光信号。只要能把这一分子事件稳定整合进一个封闭式、小型化检测装置，就有机会把高灵敏核酸检测真正向现场应用推进。

本研究构建的 peroxidase-like DNA nanomachine（PxDm）正是基于这一逻辑。系统围绕金黄色葡萄球菌 ATP-dependent nuclease subunit 基因的一段保守序列设计了三条探针：Scaffold-Probe、F-Probe 和 M-Probe。目标核酸一旦存在，就会像模板一样促使三条探针协同杂交，重建出能够折叠为 G-四链体的富鸟嘌呤区域；随后血红素结合到该结构上，形成具有过氧化物酶样催化活性的 G4/hemin DNAzyme。在加入过氧化氢后，该 DNAzyme 能催化 luminol 氧化并发出光子信号，而发光强度直接对应样品中目标核酸的存在与丰度。

图1. 基于 PxDm 的金黄色葡萄球菌 DNA 化学发光检测原理。（A）在封闭式光子计数装置中进行靶标 DNA 检测的整体示意图。（B）G4/hemin 复合体的组装过程。（C）在 G4/hemin 复合体存在下，luminol 被 H₂O₂ 催化氧化并产生化学发光的过程。（D）分体 G4 基础上的 PxDm 细菌 DNA 检测机制：有靶标时形成 G4/hemin 复合体并产生信号，无靶标时不发生有效组装。（E）PxDm 对单核苷酸错配的识别原理：错配阻断复合体形成，信号降至背景水平；完全匹配时则产生明显化学发光。

为了让这一化学发光纳米机器真正发挥最大性能，本研究首先并没有急于做实际样本检测，而是使用一个非分体 G4 DNAzyme 对核心化学发光反应进行系统优化。研究者重点考察了 pH、luminol 浓度、H₂O₂ 浓度、hemin 浓度以及预孵育时间对信号与背景比的影响。结果显示，在 pH 8.5 条件下，100 μM luminol 与 10 μM H₂O₂ 的组合给出了最高的信噪比，S/B 达到 45.3 ± 2.3。进一步优化发现，当 hemin 浓度为 1 μM 时，体系的 S/B 可提升至 74.0 ± 5.1；预孵育 5 min 足以使 G4、hemin 和 luminol 在溶液中达到有效平衡，之后继续延长时间并不会带来明显增益。

在这些条件下，化学发光动力学也得到了清晰刻画：反应在加入 H₂O₂ 后大约 30 s 达到峰值，随后逐渐衰减，因此研究者将 90 s 的积分窗口作为后续所有定量分析的统一读出时间。这个细节很重要，因为它意味着该体系并不是一个需要长时间等待的发光平台，而是能在较短时间内稳定抓住最大信号输出，这对现场检测尤其关键。

图2. G4/hemin 复合体催化化学发光反应条件优化。（A）不同缓冲液 pH 条件下，luminol 与 H₂O₂ 浓度比例对 S/B 的影响。（B）不同 hemin 浓度下 G4/hemin 复合体的 S/B 变化。（C）G4/hemin 复合体与 luminol、hemin 预孵育时间对信号的影响。（D）在优化条件下，有无 G4/hemin 复合体时化学发光反应的动力学曲线。

完成化学发光体系优化后，本研究进一步回到 PxDm 本身的结构设计。为了尽量压低背景，本研究采用了三探针而非经典二元 split G4 设计。研究者指出，传统二元分体 G4 DNAzyme 常因为两半片段在无靶标条件下发生短暂自组装而产生偏高背景，而三探针结构通过增加无靶标状态下的热力学组装门槛，有助于更有效抑制非特异发光。围绕这一点，研究者设计了两个 PxDm 版本，并故意在其中一个版本的 F-Probe 识别臂内引入单核苷酸替换，以打断 M-Probe 与 F-Probe 之间的非预期短双链配对。

结果显示，这一带有单核苷酸替换的 Construction 2 反而给出了更高的 S/B，比完全互补的 Construction 1 更优，其核心原因正是背景信号明显下降。进一步围绕 Scaffold + F 探针与 M-Probe 的浓度比例进行矩阵优化后，本研究确定 2 μM Scaffold + F 配合 1 μM M-Probe 时效果最佳，S/B 达到 13.1 ± 1.2。原位 PAGE 分析也清楚显示，在目标存在时，探针迁移带向更高分子量复合体方向移动，说明三元复合体确已成功组装。

图3. PxDm 的结构设计与参数优化。（A）利用 UNAFold 预测的 111 nt 靶标二级结构及其与 PxDm 各探针的结合位点。（B）两种 PxDm 构型比较：Construction 1 中 F-Probe 的 Arm2 与靶标完全互补；Construction 2 中 Arm2 引入单核苷酸替换以抑制 M–F 非预期配对并保留靶标结合能力。（C）两种构型在 90 s 积分化学发光信号上的表现比较。（D）Scaffold + F 与 M-Probe 不同浓度组合下的 S/B 优化结果。

在单链 DNA 检测中，PxDm 在室温条件下对 111 bp 靶标片段进行 5 min 孵育后，即可产生明显的浓度依赖性化学发光响应，单链 DNA 的检测限达到 9.7 nM。对于一个无需复杂酶促扩增、能够在封闭小体积体系中直接读出的 DNA 纳米机器而言，这一灵敏度已经相当可观。更重要的是，研究者并没有只报告“能检出”，而是系统考察了错配区分能力：面对单核苷酸替换（G→A、G→T）、双错配以及来自大肠杆菌 gyrA 的非靶标序列，信号抑制分别可达 98%、93%、98% 和 99.8%，显示出非常强的序列分辨能力。

本研究还专门评估了这一纳米机器在日常环境波动下的稳定性。结果显示，在 17 至 27 ℃ 范围内，积分 90 s 后的化学发光信号并无显著差异，说明轻微温度波动不会显著影响检测性能。试剂在室温解冻后 3 h 内可稳定使用，在 4 ℃ 下则可保存 24 h 而不明显衰减。与此同时，省略 hemin、luminol 或 H₂O₂ 任意一种组分后，信号都会降至接近仪器背景水平，从反面证明 PxDm 的信号确实来源于完整的 hemin-luminol-peroxide 级联反应，而非偶然的背景发光。

图4. PxDm 对金黄色葡萄球菌 ATP-dependent nuclease subunit A 基因目标序列的检测表现。（A）对单链靶标序列的检测结果。（B）对双链靶标序列的检测结果。通过一系列 DNA 浓度梯度确定检测限，同时在固定浓度条件下比较靶标与错配序列及非靶标序列所产生的化学发光信号，以评估体系特异性。

为了说明化学发光读出并不是“另一种可选读法”，而是真正更优的读出模式，本研究把同一 PxDm 分别接入 DAB 比色体系和 Thioflavin T 荧光体系进行对比。结果显示，比色法和荧光法对同一靶标的检测限分别为 190.4 nM 和 41.3 nM，明显高于化学发光法的 9.7 nM，也就是说，化学发光法的检测限分别降低了 19.6 倍和 4.3 倍。特异性上也同样如此：无论是单错配、双错配还是大肠杆菌非靶标，比色与荧光系统都出现更明显的交叉反应，而化学发光读出则保持了最低的背景和最高的区分度。

作者将这一优势归因于化学发光体系的几个基础特征：首先，它不需要外部激发光源，因此天然避免了样品自发荧光和散射光引起的背景噪声；其次，用于荧光读出的 ThT 本身对某些 DNA 双链结构存在非特异结合，会抬高空白信号；而 DAB 比色底物又容易发生非特异氧化和聚合，导致基线吸光度升高。正因为这三者在物理读出原理上存在差异，化学发光在灵敏度和特异性上才体现出更明显的系统性优势。

在双链 DNA 检测方面，本研究通过先将目标链与互补链退火形成双链，再引入 PxDm 进行分析，证明该平台并不限于对单链寡核苷酸的理想化识别，而是可以向更接近真实核酸样本的结构延伸。这一点为后续与扩增体系衔接提供了关键基础，也使平台具备进一步走向基因组样本检测的可能性。

真正让这个系统具备现实应用价值的是它与双引物等温扩增 DAMP 的整合。研究者设计了 6 条针对同一目标基因的引物，先进行 45 min 的等温扩增，再将扩增产物经变性后导入 PxDm 检测。这样一来，PxDm 不再直接面对极低丰度天然核酸，而是接收经 DAMP 放大的目标产物，显著提高了整体分析灵敏度。结果显示，在这一组合体系中，平台对金黄色葡萄球菌扩增产物的检测限可达到 227 个基因组当量。对于一个总分析时间约 3.5 h 的封闭式现场检测流程来说，这已经达到相当实用的灵敏度水平。

在扩增后特异性评价中，本研究仍然保持了对错配与非靶标的严格考核。结果显示，面对非目标 DNA 扩增产物和含单核苷酸替换的模拟目标扩增产物时，平台的 reduction factor 分别达到 62.1% 和 63.9%，说明即便在复杂扩增背景下，PxDm 依然能够保持较好的选择性，不会因为放大步骤引入的高丰度 DNA 产物而完全丧失判别能力。

图5. PxDm 对 DAMP 扩增产物的检测表现。（A）灵敏度评估：上部为 2% 琼脂糖凝胶显示不同浓度金黄色葡萄球菌基因组 DNA 经 DAMP 扩增后的结果，下部为对应扩增产物的化学发光响应，显示随扩增模板含量变化而产生的剂量依赖信号，并据此确定 227 个基因组当量的检测限。

在真实样品验证中，本研究把重点放在即食蔬菜场景，分别使用生菜和菠菜叶片作为食品基质模型。样品先经清洗、紫外灭菌，再分别加入约 4.25×10^2 CFU/mL 金黄色葡萄球菌或约 7.00×10^2 CFU/mL 大肠杆菌进行污染模拟，随后在 22 ℃ 条件下孵育 16 h，并通过 PBS 洗脱、CTAB 提取总 DNA，再进入 DAMP 和 PxDm 联合分析流程。

结果显示，无论是在单独污染金黄色葡萄球菌、单独污染大肠杆菌，还是两者混合污染的条件下，PxDm 都能准确给出对金黄色葡萄球菌的选择性信号。也就是说，即便样品中存在非目标菌，且检测对象来自复杂叶面洗脱物而非理想缓冲液，系统仍可维持较高识别能力。这一点非常重要，因为它说明该平台并不是只在纯化核酸体系中表现良好，而是在更接近真实食品现场监测条件下也具备足够鲁棒性。

图6. DAMP–PxDm 系统在真实样品中的检测表现。（A）从生菜和菠菜叶片中制备细菌 DNA 并进入等温扩增前的样品处理流程示意图。（B）左侧为洗脱样本 DNA 的 DAMP 扩增结果，右侧为与之对应的 PxDm 化学发光柱状图，比较金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及其混合污染条件下的检测信号。

从整体设计角度看，这项研究的价值并不只是做出一种新的 DNA 传感器，而是把几个原本分散的优势整合成了一个更接近现场应用的闭环：分体 G4 DNAzyme 负责识别与信号放大，化学发光读出降低背景噪声，封闭式光子计数装置减少外界光干扰和气溶胶污染，DAMP 扩增则把系统灵敏度推进到实际可用范围。相比依赖冷链运输和昂贵酶蛋白的某些 CRISPR 平台，这种完全基于 DNA 纳米机器的策略在储运、成本和部署灵活性上也有明显想象空间。

综上所述，本研究开发了一种面向金黄色葡萄球菌检测的化学发光类过氧化物酶 DNA 纳米机器 PxDm，并将其进一步与 DAMP 等温扩增和封闭式便携装置整合，构建出适用于食品现场筛查的分析平台。该体系在室温下即可完成检测，对单链 DNA 的检测限达到 9.7 nM，对单核苷酸错配可实现最高 98% 的信号抑制；在联合 DAMP 后，对扩增产物的检测限进一步降至 227 个基因组当量，并成功应用于生菜和菠菜等复杂样本。凭借较高灵敏度、突出的错配识别能力、较低仪器复杂度以及封闭式操作优势，这一平台为食品基质中病原菌的现场监测提供了一条具有现实可行性的技术路径。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118408