不只看抑菌圈：4小时实时追踪益生菌的抗菌实力

一、从抑菌圈终点评价到细菌倍增时间分析

传统益生菌抑菌评价常采用纸片扩散法、OD测定等方法。这些方法主要从群体水平或终点结果判断抑菌效果，例如通过抑菌圈大小评价病原菌生长是否受到抑制。然而，抑菌圈大小会受到代谢产物在琼脂中的扩散能力等因素影响。当不同益生菌产生相似的抑菌圈时，传统方法难以准确区分哪一株具有更强的抑菌作用。

针对这一问题，本研究提出一种基于随机动力学模型的细胞水平实时分析策略（图1）。该方法并不是单纯比较终点抑菌圈大小，而是通过显微成像连续记录病原菌数量变化，再利用计算机视觉算法识别和计数细菌，最后借助随机动力学模型计算细菌倍增时间。倍增时间越长，说明病原菌增殖受到的抑制越强，对应益生菌候选株的抑菌效果越好。

具体设计包括：

1.可漂浮水凝胶微胶囊体系：将益生菌封装在可漂浮的水凝胶微胶囊中，使其位于培养液上层，并持续释放低分子量分泌物；

2.病原菌实时成像与计数：病原菌位于培养孔底部，通过显微镜进行时间序列成像，并由计算机视觉算法自动识别和计数；

3.随机动力学模型分析：根据病原菌数量随时间变化的曲线计算倍增时间，以此作为评价益生菌抑菌活性的细胞水平指标。

该设计实现了从“宏观抑菌圈终点读数”向“细菌增殖过程实时量化”的转变，使益生菌抑菌效果的比较更加精细。

图1：细胞水平随机动力学评价方法与传统纸片扩散法的比较

二、益生菌抑菌作用的动态行为解析

1.可漂浮水凝胶微胶囊的构建与选择性释放

研究首先利用三重乳液滴微流控技术制备可漂浮的水凝胶微胶囊（图2）。益生菌被包裹在胶囊内部，胶囊中的低密度油相有助于其漂浮于培养液上层。通过调控内油相和预聚物相的流速，研究者获得了能够稳定漂浮的微胶囊结构。

微胶囊的关键作用在于“隔离菌体、释放代谢物”：益生菌被限制在胶囊内部，而其分泌的小分子代谢物可以透过水凝胶膜扩散到培养液中。通透性实验显示，约4 kDa的FITC-dextran能够通过胶囊膜，而70 kDa及更大分子量的荧光示踪物不能有效通过，说明该体系具备一定的分子筛选能力。

图2：可漂浮水凝胶微胶囊的制备、漂浮性调控与选择性通透性

2.益生菌-病原菌空间分离共培养与计算机视觉识别

在共培养体系中，含益生菌的微胶囊漂浮在培养液上层，病原菌则位于培养孔底部（图3）。这种空间分离设计使研究者可以直接聚焦于底部病原菌进行时间序列成像，而无需通过荧光标记或染色来区分益生菌和病原菌。与此同时，益生菌代谢产物可透过胶囊膜进入培养液，并持续作用于底部病原菌。

为实现病原菌增殖的实时定量，研究开发了计算机视觉算法。该算法首先识别显微图像中的微小物体轮廓，再根据尺寸筛除小于平均细菌轮廓直径的非细菌对象，最后对被识别的细菌进行编号和计数。该过程用于获得不同时间点的病原菌数量，从而为后续随机动力学模型拟合提供数据。

图3：益生菌-病原菌空间分离共培养体系及计算机视觉细菌识别流程

3.益生菌抑菌效应的实时动力学评估

研究进一步比较了三种益生菌对病原菌Escherichia coli KCTC 2571增殖的抑制效果，包括Lacticaseibacillus rhamnosus GG（LGG）、Lactobacillus gasseri和Lactobacillus sakei（图4）。实验采用50% MRS与50% LB的混合培养基，以兼顾益生菌和E. coli的生长需求，并尽量降低单纯营养竞争对评价结果的干扰。

结果显示，在空微胶囊对照组中，病原菌数量随时间快速增加；而在含益生菌微胶囊存在时，病原菌增殖受到不同程度抑制。通过随机动力学模型计算倍增时间后发现，L. sakei使病原菌倍增时间最长，提示其抑菌能力最强；其次为L. gasseri，LGG相对较弱。

值得注意的是，传统纸片扩散实验中三种益生菌形成的抑菌圈大小相近，约为5 mm，难以判断哪一株更优。相比之下，基于倍增时间的细胞水平方法能够在约4 h内区分不同益生菌的抑菌强弱，而纸片扩散法和OD测定等宏观评价方法通常需要≥24 h才能获得可靠结果。

图4：基于细菌倍增时间的益生菌抑菌活性评价及其与纸片扩散法的比较

三、总结与启示

本研究构建了一种结合可漂浮水凝胶微胶囊、实时显微成像、计算机视觉识别和随机动力学建模的益生菌抑菌评价平台。该平台通过持续监测病原菌数量变化，并以倍增时间作为核心指标，实现了对益生菌代谢产物抑制病原菌增殖能力的定量比较。

与传统依赖抑菌圈大小或OD变化的宏观评价方法相比，该方法更关注细菌增殖过程本身，能够识别传统方法难以区分的抑菌差异。在本研究中，纸片扩散法显示三种益生菌的抑菌圈相近，而随机动力学分析明确提示L. sakei对E. coli增殖的抑制作用最强。

从方法学角度看，该研究的创新点并不在于证明益生菌抑菌效应存在“群体内分层响应”或“概率分布右移变宽”，而在于建立了一个可实时追踪病原菌增殖并计算倍增时间的评价框架。该框架为益生菌抗菌候选株筛选提供了比传统终点评价更敏感的工具。

未来若进一步结合高通量微流控阵列、多菌株并行培养和自动化图像分析，该方法有望用于更大规模的益生菌筛选、抗菌代谢产物评价及微生物相互作用研究。不过，在实际推广中仍需进一步验证其在复杂样本、多种病原菌以及产业化筛选场景中的适用性。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.4c03003