一、级联核酸酶实现无需扩增的高灵敏检测

病原微生物感染是全球健康的重大威胁。快速、准确识别病原体对及时诊断与治疗至关重要，但传统培养法耗时数天至数周，而PCR等核酸检测虽灵敏，但需要集中实验室与专业人员，且难以在资源有限环境下推广。针对这一局限，本研究提出DNAzyme与切口核酸酶（Nicking Endonuclease）级联反应体系（DNECR），实现无需扩增即可进行高灵敏检测（图1）。

系统设计包括：

   1.多组分DNAzyme（MNAzyme）识别目标16S rRNA：利用高度保守的16S rRNA序列进行特异性结合并激活RNA切割功能。

   2.双足DNA步行器（BDW）级联信号放大：MNAzyme切割抑制块后激活BDW，在球形核酸轨道上随机步行，通过切割荧光标记底物实现二次信号放大。

   3.信号高效累积：多目标位点设计可显著提高荧光信号输出，快速生成可检测的高强度信号。

这种设计兼具特异性、灵敏性和无需扩增的优势，为现场快速检测提供了创新性解决方案。

图1 DNECR平台设计原理与级联信号放大机制

二、BDW中间体优化与信号增强

研究团队优化BDW序列结构以确保在无目标时低信号泄漏，使用6-nt链接子设计获得最佳信号/背景比（S/B=12），同时MNAzyme切割效率未受影响（图2a-d）。多靶位点检测进一步提高检测灵敏度，三重MNAzyme设计使低浓度ssDNA的检测信号加快2.7倍，显著降低检测下限（图3）。

图2 BDW中间体优化及信号放大验证

图3 多靶位点MNAzyme累积信号效果

三、培养金黄色葡萄球菌的16S rRNA检测

在提取总RNA后，DNECR可通过多个MNAzyme位点实现对105 CFU/mL金黄色葡萄球菌的信号放大。随着MNAzyme数量增加至20，S/B比提升至6.44，表现出高灵敏和高特异性，同时可区分包括克雷伯氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、链球菌和肺炎球菌等干扰菌（图4b-d）。

图4 S. aureus 16S rRNA检测性能及特异性评价

四、临床痰样验证

研究在四川大学华西医院收集12份痰样（6例阳性、6例阴性）进行DNECR检测（图5）。ROC曲线分析显示，利用预设阈值可准确区分阳性与阴性样本，检测结果与血琼脂培养法完全一致，敏感性和特异性均为100%（图5b-d）。

图5 临床痰样检测验证与ROC分析

结论

DNECR平台通过MNAzyme与双足DNA步行器的级联核酸酶反应，实现了无需扩增即可高灵敏、特异地检测金黄色葡萄球菌。该平台采用多位点MNAzyme结合BDW级联放大策略，可在复杂环境中快速生成可测信号。灵敏度可达10² CFU/mL，并在临床痰样验证中（12份样本：6阳性、6阴性）与标准血琼脂培养法完全一致，敏感性和特异性均为100%。使用6-nt链接子设计BDW，S/B比达到12（针对1 nM ssDNA标准），多靶位点MNAzyme信号加快2.7倍。平台创新性在于整合了MNAzyme和BDW两个高效信号放大体系，为现场快速病原检测提供了可靠方案。局限性包括目前仅验证金黄色葡萄球菌，未来需扩展至更多病原体，并进一步实现设备自动化与现场集成应用。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c08000