1.引言

食源性致病菌的爆发常由多种活菌共污染引起，这对快速、灵敏且能同时检测多种活菌的技术提出了迫切需求。传统的培养法虽然准确但耗时过长，而免疫分析和PCR等核酸技术则分别存在灵敏度不足或无法区分死活细胞的缺陷，难以满足风险评估的要求。尽管RNA切割型DNAzyme（RCD）能通过识别活菌分泌的蛋白来解决特异性问题，但现有方法普遍存在荧光信号单一、无法实现多重检测，且灵敏度难以达到相关标准。此外，大多数平台也无法并行处理大量样本，限制了其在大规模筛查中的应用。

本研究开发了DNAzyme驱动的滚环扩增/分子信标编码系统（DRM-ES），通过耦合智能手机卷积神经网络（CNN）的方法，解决了传统技术难以对多种活细菌进行高通量、高灵敏度同时检测的问题。在实验方法上，该研究利用特异性RCD识别活菌并启动滚环扩增，产生长单链DNA作为支架，进而杂交不同荧光标记的分子信标以实现多重编码。随后，利用智能手机采集荧光信号，并借助深度学习算法对图像进行自动分析与分类，实现了对复杂样本中多种病原菌的精准识别与定量。

2.结果与讨论

DRM-ES检测原理与多重识别流程：利用病原体分泌蛋白特异性切割RCD释放sRF以启动RCA反应，结合光谱独特的分子信标（MB）杂交产生颜色编码荧光信号，通过智能手机采集荧光图像并由计算机端CNN解码，实现了对金黄色葡萄球菌、椰毒假单胞菌和大肠杆菌的身份鉴定与浓度定量。

图 1 (A) DRM系统运行原理：病原体分泌的特定蛋白会切割其对应的RNA切割型脱氧核酶（RCD），释放出短RCD片段（sRF）；该片段作为引物，在病原体特异性环状模板上启动滚环扩增（RCA）反应；扩增产物（RP）随后打开具有不同光谱特征的分子信标（MB），从而产生颜色编码的荧光信号。图中R代表腺嘌呤核糖核苷酸，F代表荧光基团，Q代表淬灭剂。(B) 多重识别工作流程：混合病原体在反应中会生成独特的颜色特征信号，这些信号被智能手机捕获并解码。需要特别注意的是，智能手机在此过程中仅专用于图像采集，而所有的深度学习推理分析（如物种鉴定与浓度定量）均在计算机端完成。

DRM-ES系统的组装与特异性验证：利用细菌特异性切割RCD释放sRF启动RCA扩增，结合琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱表征，确认仅在对应sRF/CT配对时生成>10 kb产物且MB特异性杂交，优化反应条件为30℃孵育30分钟，实现了单一及混合病原体的多重颜色编码与无交叉反应检测。

图 2 DRM-ES系统的组装与特异性验证：(A) RCD-SA、RCD-BC和RCD-EC的荧光响应（反应条件：37℃，60分钟）显示，仅在存在其对应靶标细菌时才发生选择性切割。(B) 琼脂糖凝胶电泳（反应条件：30℃，2小时）证实，仅在存在正确的sRF/CT（短RCD片段/环状模板）配对时，才会生成大于10 kb的RCA扩增产物，且未观察到交叉引发（非特异性扩增）现象。(C) 温度扫描（反应时间：10分钟）表明，分子信标（MB）的荧光仅在与其匹配的RCA产物（RP）杂交时才被激活；只有在温度高于55℃时，才会因热变性导致信标打开。(D) RP-MB配对的热力图（反应条件：30℃，10分钟）显示，强烈的荧光信号仅局限于对应的同源组合中。(E) 多重颜色编码：在sRFs和CTs存在的情况下，所有单一、二元及三元RP/MB混合物的荧光光谱（反应条件：30℃，30分钟）及智能手机拍摄图像（插图）。蓝色通道：激发/发射波长为350/440 nm；绿色通道：494/518 nm；红色通道：643/667 nm。LT，线性模板；M，DNA分子量标记。误差棒表示标准差（n = 3）。

DRM-ES的定量检测性能与CNN分析：利用不同浓度细菌产生的荧光强度差异，结合智能手机成像与卷积神经网络（CNN）算法，建立细菌浓度与荧光信号的线性回归模型，确定检测限低至10¹–10² CFU/mL，实现了对活细菌的高灵敏度定量分析及智能手机端的自动化识别。

图 3 DRM-ES的分析性能评估：(A) 荧光强度增加（ΔF）随细菌浓度的变化趋势及代表性智能手机图像（顶部）。金黄色葡萄球菌（SA）的浓度范围为10²–10⁸ CFU/mL，椰毒假单胞菌（BC）和大肠杆菌（EC）为10¹–10⁷ CFU/mL；对应的检测限（LOD）分别为：SA 10² CFU/mL，BC和EC 10¹ CFU/mL。(B) 特异性测试面板：仅靶标细菌（SA、BC、EC）能产生其指定的颜色编码信号；非靶标菌株（AA、BS、PA）无信号（保持暗态）。(C) 多重检测能力：单菌株（P1–P3）及所有混合菌株（P4–P7）的荧光图像（底部）及相应的ΔF值（顶部）。纯培养物与混合培养物之间未观察到具有统计学意义的差异（单因素方差分析，p > 0.05）。蓝色通道：激发/发射波长 350/440 nm；绿色通道：494/518 nm；红色通道：643/667 nm。误差棒表示标准差（n = 3）。

DRM-ES的分析性能与多重检测能力：利用不同浓度病原体引发的荧光强度梯度变化，结合智能手机成像获取单菌株及混合菌株的荧光图像，确定检测限低至10¹-10² CFU/mL且混合样本无显著干扰，实现了对金黄色葡萄球菌、椰毒假单胞菌和大肠杆菌的高灵敏度定量及特异性多重识别。

图 4 DRM-ES图像的深度学习定量分析：(A) CNN工作流程：使用2800张智能手机图像（70%用于训练，15%用于验证，15%用于测试）来训练卷积神经网络（CNN），以实现细菌物种的同时分类和浓度的回归分析。(B) 物种识别的混淆矩阵（平均准确率达93.8%）。(C) 留出测试集的预测浓度与实际浓度对比图；对于所有三种病原体，决定系数（R²）均 ≥ 0.979，且平均绝对误差（MAE）≤ 0.284。误差棒表示标准差（n = 3）。

DRM-ES在真实基质中的即时检测验证：利用标准化样本前处理流程处理银耳、尿液及河水中的混合病原体，结合智能手机成像与CNN智能解码分析检测结果，验证了系统在60份加标样本中达到100%阳性符合率及≥95.2%阴性符合率，实现了与细菌培养法高度一致且适用于复杂环境的现场即时检测。

图 5 DRM-ES在真实基质中的即时检测（POCT）验证：(A) 银耳、尿液和河水样本中细菌检测的标准化工作流程：在基质中添加混合病原体，进行DRM-ES反应，使用智能手机拍摄图像，并由CNN解码(B) 银耳、(C) 尿液和 (D) 河水加标细菌样本的对比结果。(E) 60个加标样本的一致性总结：与细菌培养法相比，DRM-ES表现出100%的阳性符合率（PPA）和≥95.2%的阴性符合率（NPA）。Pos：阳性；Neg：阴性。

DRM-ES阵列的大规模筛查与临床验证：利用标准化裂解流程处理32份银耳样本，结合4×8微孔板阵列单帧成像与CNN解码分析检测性能，通过细菌计数对比及ROC曲线评估，证实了该方法在复杂基质样本大规模筛查中具备与培养法高度一致的准确性及优异的区分能力。

图 6 基于智能手机的DRM-ES阵列对受污染银耳样本的大规模筛查：(A) 识别受不同细菌污染的银耳的标准化工作流程：用缓冲液提取细胞，裂解后进行DRM-ES反应，使用智能手机拍摄图像，并由CNN进行解码。(B) 4 × 8 微孔板阵列的单次荧光图像，可同时捕获所有颜色编码信号。(C) 对32份样本，分别通过DRM-ES与细菌培养法获得的细菌计数对比结果。(D) 用于分析不同细菌的受试者工作特征（ROC）曲线。

3.总结

本文构建的DRM-ES系统通过耦合细菌特异性响应机制与智能手机深度学习分析，成功突破了传统病原体检测的局限。其核心优势在于实现了高灵敏度、多重特异性识别与现场即时检测的有机统一：不仅能以极低检测限精准区分混合感染中的不同菌株，还通过CNN算法消除了人工判读误差。在银耳、尿液等复杂基质的大规模筛查中，该系统展现出与标准培养法高度一致的准确性与稳健性，为食品安全监控及临床快速诊断提供了一种低成本、便携且高效的创新解决方案。

论文链接： https://doi.org/10.1002/ange.4446117