基于多孔板表面增强拉曼光谱（SERS）平台、细菌表面金纳米层包覆技术的高灵敏无标记细菌检测及快速抗生素敏感性测试

1.引言

现有临床检测技术短板

（1）传统细菌培养法（金标准）：耗时 24–48 h，药敏需 24–72 h，延误脓毒症等急症救治，催生广谱抗生素滥用、耐药菌泛滥；

（2）分子诊断（PCR / 抗原检测）：受菌种基因多样性、交叉反应干扰，特异性不足；

（3）MALDI-TOF 质谱：依赖细菌预培养、设备昂贵、需专业人员，基层无法普及；

（4）现有 SERS 细菌检测：纳米热点（1–10 nm）与微米级细菌尺寸严重失配，细菌表面等离子覆盖不全，信号弱、检出限高，且难以实现高通量药敏同步筛查。

现有 SERS 方案缺陷

常规二维 SERS 基底、纳米颗粒混合体系无法完整包覆细菌，丢失细菌特征拉曼指纹；且多为单样本检测，无法并行多抗生素药敏测试，规模化临床应用受限。

本文研究方案

构建 96 孔金海绵 SERS 基底 + 原位细菌金纳米涂层（PNA） 一体化平台：

一步无电沉积在商用多孔板制备 3D 金海绵 SERS 活性基底；

在孔内细菌表面原位催化生长连续 AuNL，全域构筑电磁热点，大幅放大细菌拉曼信号；

结合化学计量学实现 5 种尿路致病菌精准区分，同时完成 1–2 h 快速药敏评估，面向尿路感染床旁即时检测（POCT）。

2.结果与讨论

左侧：96 孔板无电化学镀金，生成多孔金海绵（AuS）SERS 基底；

右侧：检测流程 —— 菌液 + 金种子 + 氯金酸 / 盐酸羟胺原位还原，细菌外壁包覆 AuNL，激光原位采集 SERS 信号；

核心逻辑：AuS 提供底层等离子基底，AuNL 包裹细菌消除尺寸失配，全方位产生拉曼增强热点。

2a 工艺分步：细菌吸附→金纳米颗粒附着（成核位点）→原位金还原包覆→细菌捕获与信号采集；

2b SEM：纯 AuS 为多孔海绵；无细菌时 AuNL 呈尖刺结构；有细菌时 AuNL 沿菌体圆润包覆，证实细菌诱导金层生长；

2c TEM/EELS/ 高分辨 TEM：细菌表面 AuNL 厚度 50–80 nm，Au 元素完全覆盖菌体，晶格匹配 Au (111) 晶面，仅包覆细胞外壁、不侵入胞内，信号来自菌体表面生物大分子；

2d FDTD 电磁场模拟：无 PNA 时热点仅存在基底间隙；包覆 AuNL 后菌体全域产生高强度局域电场，信号增强倍数大幅提升；

2e–g 实时监测：金包覆 30 min 内拉曼强度持续放大，733 cm⁻¹ 特征峰饱和，确定最优反应时长 30 min。

3a/b 革兰阴 / 阳性菌形貌差异

革兰氏阴性菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）：肽聚糖层薄，金纳米颗粒吸附位点多，AuNL 致密（50–80 nm）；

革兰氏阳性菌（粪肠球菌、腐生葡萄球菌）：厚磷壁酸肽聚糖层，成核位点少，AuNL 稀疏（30–50 nm）；EELS 均证实菌体表面全覆盖金层。

3c 菌种特征拉曼指纹：5 种细菌拥有共有特征峰（730、1004 cm⁻¹ 等），同时存在菌种独有特征峰，革兰阳性菌在 770–784 cm⁻¹ 存在特有磷壁酸峰，可区分革兰分型。

3d 检出限（LOD）：大肠杆菌 10³ CFU/mL；其余 4 种致病菌 10⁴ CFU/mL，低于临床尿路感染诊断临界值（10⁵–10⁶ CFU/mL）。

3e PCA、3f OPLS-DA：两种多元分析均可完全分离 5 种菌种；OPLS-DA 一对一分类准确率 100%，低浓度下无错分。

4a 阿米卡星浓度梯度 MIC 测定：随抗生素浓度升高，SERS 信号持续衰减；≥0.05 mg/mL 时信号几乎消失，与临床标准 MIC 匹配；

4b 时效对比（阿米卡星 vs 氨苄西林）：阿米卡星 20 min 即可完全抑菌（无信号）；氨苄西林抑菌慢，120 min 仍残留近 50% 信号，两种抗生素抑菌动力学差异可通过拉曼定量区分；

4c 四类抗生素对 5 种菌抑菌谱：阿米卡星、喹诺酮杀菌效果极强（残留信号＜2.5%）；氨苄西林、头孢抑菌弱，部分菌株出现明显耐药特征；与纸片扩散法药敏结果高度吻合；

4d 重复性：10 组平行测试 RSD 均＜11%，平台稳定性满足临床检测要求。

3.总体结论

技术突破：提出 PNA 原位金包覆策略，彻底解决微米细菌与纳米 SERS 热点几何失配难题，基于商用 96 孔板搭建高通量 SERS 一体化检测平台；

检测性能：无预培养、30 min 完成致病菌检出，检出限达 10³–10⁴ CFU/mL；PCA+OPLS-DA 模型实现 5 种临床尿路致病菌 100% 精准区分；

药敏优势：药敏检测仅需 1–2 h，远优于传统 24–72 h 培养法，可快速评估阿米卡星、氨苄西林等多种抗生素抑菌效果，清晰区分菌株耐药表型；

临床适配性：尿液简单预处理即可消除基质干扰，平台重复性好、耗材成本低，适配尿路感染床旁即时诊断，减少广谱抗生素滥用、遏制耐药菌传播；

不足与展望：当前仅模拟加标尿液样本，后续需开展大规模双盲临床样本验证；未来可集成自动化前处理设备，开发便携一体化全自动微生物诊断设备。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.173940