“Ago”引发的可视化和无重建食源性致病菌检测

  近年来，基于PfAgo(Pyrococcus furiosus Argonaute)和TtAgo(Thermus thermophilus Argonaute)的核酸检测技术由于Argonaute的可编程性和高特异性而不断研究和建立。与CRISPR/Cas系统相比，Argonaute介导的生物传感器还具有较高的特异性核酸识别能力，不需要依赖PAM序列的限制。因此，它具有更容易实现多重检测的优点。

  目前，Argonaute在核酸检测领域已经取得了惊人的成绩，成为生物传感器和检测研究的热点。基于Argonaute的检测系统是依赖于Argonaute的两步切割。一方面，两步切割是测试结果准确性的进一步保证。另一方面，也有一些固有的缺点。例如，两步切割需要多个向导DNA的参与。这样，首先延长了整个检测时间，然后通过使用多种修饰核酸增加了反应体系的复杂性和成本。而且，在两步裂解法中，第二反应步骤是由第一步产生的切割产品触发的，这无疑会影响裂解效率，导致检测灵敏度的牺牲。对此，Tag特异性引物的引入为解决上述局限性提供了一种替代策略，可以通过用设计的引物扩增向靶标添加向导DNA/RNA来实现一步切割。

  该文章提出了一种将Tag特异性引物和核酸外切酶I与PfAgo整合的通用且无重建的食源性致病菌检测的一步切割方法，并对该设计的实用性进行了测试。

  (一)该平台的检测原理

  如图A所示，NOTE-Ago测定是一步切割，没有通过标签特异性引物Exo I和PfAgo的组合引入多个向导DNA。为NOTE-Ago测定设计的标签特异性引物由两个功能不同的部分组成：3'末端的特异性引物序列(蓝色)与靶标匹配，5'末端的标签序列(黄色)与报告基因匹配。理论上，Exo I特异性地从ssDNA的3'末端水解ssDNA。因此，只有在存在目标核酸的情况下才能触发系统。详细地说，扩增后，剩余的引物被Exo I完全消化。相反，扩增产物为带有Tag序列的dsDNA，可以有效保护其免受Exo I降解。当富集扩增子在反应缓冲液中与PfAgo混合时，富集扩增子上的Tag序列将作为PfAgo基于互补序列识别和裂解荧光团猝灭报告基因的指南，导致荧光基团的释放和荧光的增加。

  图1 基于PfAgo系统的NOTE-Ago测定示意图

  (二)NOTE-Ago生物传感策略的可行性和优化

  如图A和B所示，在没有靶核酸和Exo I的情况下，Tag特异性引物可用作Pf Ago激活PfAgo的指南，从而产生荧光信号。使用Exo I，Tag特异性引物被酶水解，不能激活PfAgo。因此，该系统仍然没有反应。

  图2 NOTE-Ago生物传感器条件优化结果

  (三)NOTE-Ago生物传感器的性能

  如图所示，可以注意到伤寒沙门氏菌(图 A)和金黄色葡萄球菌(图B)的阳性和阴性样品之间的荧光强度有明显区别。值得一提的是，所提出的生物传感策略还可以在极低浓度下检测伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，并且与阴性对照有显着差异。NOTE-Ago检测方法对伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测限都为1 CFU/mL。

  图3 NOTE-Ago检测平台的特异性和灵敏度

  如下图A所示，与所提出的NOTE-Ago检测方法相比，结果表明NOTE-Ago检测平台能够证明来自17个可疑样品的24个伤寒沙门氏菌样品的合理性。对于伤寒沙门氏菌的检测，无论是基于SG(83.3%)还是TaqMan(91.7%)的qPCR，检测的准确性都无法与NOTE-Ago检测平台(100%)相匹配。观察到所有17个加标伤寒沙门氏菌样品的FL水平均高于7个正常样品(图B)。ROC(受试者工作特性)曲线表明，由于NOTE-Ago测定的曲线下面积(AUC)为1.0，灵敏度和特异性为100%，因此所提出的方法在检测伤寒沙门氏菌方面优于基于SG和TaqMan的qPCR(图C)NOTE-Ago测定在检测金黄色葡萄球菌方面也显示出令人满意的结果(图E- F)。

  图4 NOTE-Ago检测平台的性能

  (四)NOTE-Ago生物传感策略在食品样品检测中的应用

  NOTE-Ago测定法检测鸡蛋样品中的伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。均可以到达100 CFU/ml。

  图5 NOTE-Ago检测平台的实用性

  (五)结论

  该研究提出了一个通用且无需重建的检测平台，该平台结合了标签特异性引物和PfAgo，以超灵敏地检测食源性致病菌，如伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，称为NOTE-Ago。所提出的生物传感器的性能非常出色，其最低的LoD值(1 CFU/mL)和最宽的检测范围(100到 108CFU/mL。3D打印荧光阅读器可作为可视化荧光信号的工具，进一步增强了NOTE-Ago测定的需求点(PON)能力。NOTE-Ago检测具有区分多重致病菌检测靶标的能力。最后，伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌污染的食品样品也证实了NOTE-Ago测定的令人满意的选择性。这项工作扩展了基于Argonaute的检测工具箱，提出了一种新颖且无需重建的食源性病原菌检测传感平台，具有简单、灵敏和准确的检测能力，具有多重检测的潜力。

  参考文献

  [1] Li, Yaru et al. “Argonaute-triggered visual and rebuilding-free foodborne pathogenic bacteria detection.” Journal of hazardous materials vol. 454 (2023): 131485.