临床上细菌感染的多重检测和特异性鉴别

  摘要：一种能同时灵敏检测和鉴定多种细菌的新型横向流动免疫测定条(LFIA)仍然是一个巨大的挑战。在这项研究中，我们首先开发了具有比色-SERS-光热-催化(CM/SERS/PT/CL)特性的多功能海胆形状Au-Ag@Pt纳米粒子(UAA@P NPs)，并将其与LFIA结合，用于血液样品中致病菌的多重检测和特异性鉴别。与依赖抗体(Ab)的传统LFIA不同，这种新型LFIA引入了4-巯基苯硼酸(4- MPBA)作为理想的Ab替代品，它在UAA@P NPs (UAA@P/M NPs)上功能化，对细菌具有出色的结合和富集能力。以金黄色葡萄球菌(S. aureus)为模式菌，SERS-LFIA的检出限(LOD)为3 CFU/mL, PT-LFIA为27 CFU/mL, CL-LFIA为18 CFU/mL，其中3种检测灵敏度分别比普通视觉CM-LFIA高330倍、37倍和55倍以上。此外，该SERS-LFIA能够根据特定的细菌拉曼“指纹图谱”，通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)有效识别三种细菌加标血液样品(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)。更重要的是，该LFIA成功地应用于血液样品，回收率为90.3% ~ 108.8%，能够从健康受试者(N = 2)中识别出感染患者(N = 4)，准确度很高。总之，多模态LFIA结合了细菌鉴别和定量检测，为细菌感染的早期预警和诊断提供了途径。

  设计思路如下：本文通过种子介导法和原位还原法制备了UAA@PNPs，与其他多金属纳米粒子相比，本研究设计的UAA@P纳米粒子(1)通过合理调整Pt层厚度，同时具有不减弱的等离子体活性和稳定的纳米酶催化活性;(2)能够吸收近红外(NIR)光，使其具有光热性能;(3)具有较大的表面积和良好的表面反应性，使其易于与4-MPBA (UAA@P/M NPs)功能化，用于细菌捕获。靶菌浓度越高，CM-LFIA的T线颜色越深，SERS-LFIA的拉曼强度越高，PT-LFIA的温度变化越大，CL-LFIA的催化反应越强。当样品溶液中含有多个目标细菌时，会形成不同的UAA@P/M NPs -细菌复合物，4-MPBA的拉曼“指纹图谱”在T线上会出现相应的变化，可用于区分不同种类的细菌。因此，基于UAA@P/M NPs的多模态LFIA实现了病原菌的超灵敏检测和特异性鉴别。

  在最佳条件下通过比色信号、SERS信号、催化信号和热信号读出，进行LFIA定性和定量模式检测不同浓度的金黄色葡萄球菌。CM-LFIA定量分析，随着目标病原体浓度的增加，T线上的黑色带逐渐加深，范围为101 ~ 107 CFU/mL(图A)。肉眼检出限(vLOD)约为1×103 CFU/mL。为了进行CL-LFIA定量分析，从整个试纸上切下细菌捕获后的T线，浸入TMB/H2O2底物中。从图B可以看出，随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，颜色迅速变为蓝色，oxTMB (652 nm)的吸收光谱信号逐渐增加，范围在102 ~ 107 CFU/mL之间。与常规CM-LFIA相比，CL-LFIA的灵敏度得到了显著提高(图C)。为了对PT-LFIA进行定量分析，在0.8 W cm−2的近红外辐射(808 nm)照射3分钟后，立即用红外摄像机监测UAA@P/M NPs介导的LFIA的热变化。同样，当细菌浓度从102 CFU/ mL增加到107 CFU/ mL时，T线捕获到更多UAA@P/M NPs -细菌复合物，并伴随着热像仪记录的温度升高(图G)。根据获得的SERS结果，随着金黄色葡萄球菌浓度在101 ~ 107 CFU/mL范围内的增加，T线选定区域UAA@P/M NPs的SERS强度明显增加(图D和E)。获得的SERS图谱在测试区显示出均匀的信号输出(图F)，具有很强的再现性。SERS/PT/ CL-LFIA法的LOD分别为3、27、18 CFU/mL，分别比CM-LFIA法的LOD高330倍、37倍和55倍。更重要的是，该LFIA结合了多模态传感，不仅继承了彼此互补的优势，而且提供了更多的检测选择和结果的双重检查，提高了检测的准确性和可靠性。

  为了考察基于UAA@ P/M NPs的LFIA试纸对细菌的鉴别性能，我们将抗金黄色葡萄球菌、抗铜绿假单胞菌和抗大肠杆菌三种细菌捕获抗体分别分配到NC膜上，构建三条T线(大肠杆菌T1、铜绿假单胞菌T2、金黄色葡萄球菌T3)。样品中含有105 CFU/mL的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌或其混合物，在相同条件下通过LFIA直接检测。如下图A所示，分别检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌时，T1线、T2线、T3线仅出现一条暗带，而同时存在三种或双靶病原菌时，则出现三条或两条暗T线。此外，三种病原菌在试验区未发生交叉反应，说明所使用的抗体在试纸条上无非特异性吸附，具有良好的选择性。此外，菌落生长的不同形状进一步证明了T线上不同细菌样品的测定结果(见图C)。此外，不同批次(每个菌种10批次)相似的细菌“指纹”进一步表明，鉴别结果具有良好的再现性和可靠性(图4E−H)。将得到的SERS光谱通过PLS-DA算法进行建模和分类，DA结果的三维地图如图I所示，其中绿色球代表纯UAA@P/M NPs，蓝色球代表大肠杆菌，红色球代表金黄色葡萄球菌，黄色球代表铜绿假单胞菌。PLS-DA分析表明，三种不同的细菌可根据其独特的细菌指纹图谱成功分类。因此，我们在LFIA传统优势的基础上，结合SERS技术提高检测灵敏度，对不同类型的细菌具有较好的区分能力。更重要的是，SERS可以通过指纹识别有效避免假阳性和假阴性结果，使检测结果更加准确可靠。

  随后，对一系列不同浓度目标病原菌的血样进行检测，随着金黄色葡萄球菌加标浓度的增加，T线上的信号强度逐渐增加。此外，血液样品的两株细菌沿着对角线有效分离，没有任何重叠。所有这些算法计算的结果表明，这种新的LFIA可用于血液样本的细菌分类，具有高灵敏度和特异性。进一步采集健康志愿者和金黄色葡萄球菌感染患者的6份真实血液样本进行检测，由医院临床检验科提供，采用标准平板计数法进行鉴定。只有两例患者的T线上有黑色带与医院结果一致，其他三例患者的试纸条上没有彩色带，结果与健康人群相似(下图G)。因此，传统的CM-LFIA可以识别严重感染的患者，但由于其敏感性较低，难以用于轻度细菌感染的患者。然而，高灵敏度的SERS- LFIA可以成功检测到患者标本，显示出金黄色葡萄球菌对应的指纹识别带，而健康受试者未观察到明显的SERS信号(图H)。为了满足POCT的要求，还使用便携式拉曼光谱仪对临床样品进行测量。对于感染患者的样本，所有病例均检测为阳性，进一步验证了我们的SERS-LFIA的准确性和实用性。因此，CM-LFIA操作简单，能够快速检测临床样品，而SERS-LFIA在提供特异性指纹信息的同时，实现对轻度细菌感染的准确检测，与医院方法相比，在细菌感染的早期预警和诊断方面具有明显优势。

  总结：

  综上所述，作者建立了一种基于UAA@P/M NPs的多功能LFIA，用于血液样品中多种致病菌的灵敏检测和特异性鉴别。与传统的单信号LFIA相比，该新型LFIA集成了两种定性检测模式(CM/SERS-LFIA)和三种可转换定量检测模式(SERS/PT/CL)，可以满足目标细菌的多种检测灵敏度要求。多重读数结果表明，所建立的LFIA与金黄色葡萄球菌具有良好的线性关系，SERS/PT/CL法的LOD分别为3、27和18 CFU/mL。通过对细菌独特指纹图谱的PLS-DA分析，利用SERS-LFIA对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌3种病原菌进行了快速、同步的分类。在实际应用中，这种新型的LFIA可以成功地用于区分感染患者和健康受试者，准确率很高。

  参考文献：

  Huang X, Chen L, Zhi W, et al. Urchin-Shaped Au–Ag@ Pt Sensor Integrated Lateral Flow Immunoassay for Multimodal Detection and Specific Discrimination of Clinical Multiple Bacterial Infections[J]. Analytical Chemistry, 2023.